Name: isolation of ribosome bound nascent polypeptides in vitro to identify translational pause sites along mrna
Uploaded: 2012-07-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA at JoVE.com

Questo lavoro è stato finanziato dal programma Human Frontier Science concessione RGP0024.

1. Preparazione del DNA template e trascrizione in vitro <ol><li> Il gene di interesse viene clonato sotto T7 e / o ad esempio SP6 promotore di trascrizione. </li><li> Per la trascrizione in vitro del DNA stampo è linearizzato con un enzima di restrizione appropriato taglio a valle del codone di stop ORF e / o mRNA 3 &#39;. Si deve verificare linearizzazione completa del DNA plasmide eseguendo il prodotto della digestione di restrizione elettroforesi su gel di agarosio. </li><li> I...

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	<li>Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pause+for+thought+along+the+co-translational+folding+pathway.">A pause for thought along the co-translational folding pathway.</a> Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).</li><li>Sharp, P. M., Cowe, E., Higgins, D. G., Shields, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon+usage+patterns+in+Escherichia+coli,+Bacillus+subtilis,+Saccharomyces+cerevisiae,+Schizosaccharomyces+pombe,+Drosophila+melanogaster+and+Homo+sapiens;+a+review+of+the+considerable+within-species+diversity.">Codon usage patterns in Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Drosophila melanogaster and Homo sapiens; a review of the considerable within-species diversity.</a> Nucleic Acids Res. 16, 8207-8210 (1988).</li><li>Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+differences+in+human+transfer+RNA+expression.">Tissue-specific differences in human transfer RNA expression.</a> PLoS Genet. 2, e221 (2006).</li><li>Ikemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon+usage+and+tRNA+content+in+unicellular+and+multicellular+organisms.">Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms.</a> Mol. Biol. Evol. 2, 13-34 (1985).</li><li>Wolin, S. L., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+pausing+and+stacking+during+translation+of+a+eukaryotic+mRNA.">Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA.</a> EMBO J. 7, 3559-3569 (1998).</li><li>Krasheninnikov, I. A., Komar, A. A., Adzhubei, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonuniform+size+distribution+of+nascent+globin+peptides,+evidence+for+pause+localization+sites,+and+a+cotranslational+protein-folding+model.">Nonuniform size distribution of nascent globin peptides, evidence for pause localization sites, and a cotranslational protein-folding model.</a> J. Protein Chem. 10, 445-454 (1991).</li><li>Komar, A. A., Lesnik, T., Reiss, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synonymous+codon+substitutions+affect+ribosome+traffic+and+protein+folding+during+in+vitro+translation.">Synonymous codon substitutions affect ribosome traffic and protein folding during in vitro translation.</a> FEBS Lett. 462, 387-391 (1999).</li><li>Komar, A. A., Jaenicke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+translation+of+&#947;+B+crystallin+and+its+circularly+permutated+variant+in+an+in+vitro+cell-free+system:+possible+relations+to+codon+distribution+and+protein+folding.">Kinetics of translation of &#947; B crystallin and its circularly permutated variant in an in vitro cell-free system: possible relations to codon distribution and protein folding.</a> FEBS Lett. 376, 195-198 (1995).</li><li>Jha, S., Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth,+life+and+death+of+nascent+polypeptide+chains.">Birth, life and death of nascent polypeptide chains.</a> Biotechnol. J. 6, 623-640 (2011).</li><li>Thanaraj, T. A., Argos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome-mediated+translational+pause+and+protein+domain+organization.">Ribosome-mediated translational pause and protein domain organization.</a> Protein Sci. 5, 1594-1612 (1996).</li><li>Kimchi-Sarfaty, C., Oh, J. M., Kim, I. W., Sauna, Z. 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Biochem. 166, 368-379 (1987).</li><li>Shirole, N., Balasubramanian, S., Yanofsky, C., Cruz-Vera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Translating+Ribosomes+Containing+Peptidyl-tRNAs+for+Functional+and+Structural+Analyses.">Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses.</a> J. Vis. Exp. (48), e2498 (2011).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li></ol>

Per risultati riproducibili, la qualità e la concentrazione dei componenti utilizzati per la trascrizione in vitro e le reazioni di traduzione sono critiche. In questo studio abbiamo usato i kit disponibili in commercio e gli estratti che forniscono dati altamente riproducibili, se maneggiato con cura. Tuttavia, traduzione-competenti estratti possono essere preparati dalla cella di propria scelta, se necessario. Qualità di mRNA può influenzare la traduzione, quindi è della massima importanza per testare l&#...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / Kit </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 alta Kit Trascrizione rendimento </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> Ribonucleasi Inhibitor </td><td> Invitrogen </td><td> 15518012 </td></tr><tr><td> Trans [35 S]-Label </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0151006 </td></tr><tr><td> Ribonucleasi-A </td><td> Invitrogen </td><td> 12091 </td></tr><tr><td> Coniglio reticolociti sistema Lysate, nucleasi trattato </td><td> Promega </td><td> L4960 </td></tr><tr><td> Sistema di E. coli per i modelli S30 estratto lineari </td><td> Promega </td><td> L1030 </td></tr><tr><td> Centrifugazione </td><td> Beckman Coulter </td><td> Optima TLX ultracentrifuga </td></tr><tr><td> Stoccaggio fosforo autoradiography </td><td> GE Healthcare </td><td> Typhoon 9410 imager modalità variabile </td></tr><tr><td> Software per l&#39;analisi nascente polipeptide </td><td> GE Healthcare </td><td> Immagine Quant TL, v2005 </td></tr></tbody></table>

isolation of ribosome bound nascent polypeptides in vitro to identify translational pause sites along mrna

Il tasso di allungamento traslazionale è non uniforme. mRNA struttura secondaria, l&#39;uso codone mRNA e proteine ​​associate possono alterare il movimento ribosoma sul messaggio per una rassegna vedi 1. Tuttavia, è ormai ampiamente riconosciuto che l&#39;utilizzo codone sinonimo è la causa primaria di non-uniformi tassi di allungamento traslazionali 1. Codoni sinonimo non vengono utilizzati con frequenza identica. Una polarizzazione esiste l&#39;uso di codoni sinonimo con alcuni codoni usati più frequentemente di altri 2. Codone bias è organismo così come tessuto specifico 2,3. Inoltre, la frequenza di uso dei codoni è direttamente proporzionale alla concentrazione delle affine tRNA 4. Così, un codone frequentemente usato avrà maggiore moltitudine di tRNA corrispondenti, implicando che un codone di frequente si tradurrà più velocemente di un infrequente uno. Così, regioni mRNA arricchito in codoni rari (siti pausa potenziali) saranno di regola rallentare il movimento del ribosoma Message e causa l&#39;accumulo di peptidi nascenti delle rispettive dimensioni 5-8. Questi siti di pausa può avere un impatto funzionale l&#39;espressione della proteina, la stabilità mRNA e folding delle proteine ​​per una rassegna vedi 9. Infatti, è stato dimostrato che la riduzione di tali siti di pausa può alterare il movimento ribosoma mRNA e successivamente possono influenzare l&#39;efficienza di co-traduzionale (in vivo) 1,7,10,11 ripiegamento delle proteine. Per comprendere il processo di ripiegamento delle proteine ​​in vivo, nella cella, che è accoppiato alla fine al processo di sintesi proteica è essenziale di acquisire informazioni complete sull&#39;impatto codone di utilizzo / tRNA contenuto sul movimento dei ribosomi lungo mRNA durante l&#39;allungamento traslazionale . Qui si descrive una tecnica semplice che può essere utilizzata per localizzare siti di traduzione principali pausa per un dato mRNA tradotto in vari sistemi acellulari 6-8. Tale procedura si basa sull&#39;isolamento del nascente polipeptidi accumulating sui ribosomi durante la traduzione in vitro di un mRNA bersaglio. La ragione è che a bassa frequenza codoni, l&#39;aumento del tempo di residenza dei risultati ribosomi in quantità maggiore di peptidi nascenti delle dimensioni corrispondenti. In vitro mRNA trascritti viene utilizzato per reazioni di traslazione in vitro in presenza di amminoacidi marcati radioattivamente per consentire il rilevamento delle catene nascenti. Al fine di isolare ribosoma associazione complessi polipeptide nascente la reazione di traduzione è sovrapposto di soluzione di glicerolo 30% seguito da centrifugazione. Polipeptidi nascenti in polysomal pellet sono ulteriormente trattati con ribonucleasi A e risolti mediante SDS PAGE. Questa tecnica può essere potenzialmente utilizzati per ogni proteina e permette l&#39;analisi di movimento ribosoma lungo mRNA e la rilevazione dei siti di pausa principali. Inoltre, questo protocollo può essere adattato per studiare fattori e condizioni che possono alterare il movimento ribosoma e quindi potenzialmente possono anche alterare the funzione / conformazione della proteina.

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Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Una tecnica per identificare i siti di pausa traslabile su mRNA viene descritto. Questa procedura è basata su isolamento di polipeptidi nascenti accumulano sui ribosomi durante traduzione in vitro di un mRNA bersaglio, seguita dall&#39;analisi dimensione delle catene nascenti elettroforesi utilizzando un gel denaturante.

Isolamento dei ribosomi Polipeptidi Bound nascenti<em&gt; In vitro</em&gt; Per identificare i siti di pausa traslazione lungo mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Research

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