Name: isolation of ribosome bound nascent polypeptides in vitro to identify translational pause sites along mrna
Uploaded: 2012-07-06T13:00:00
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この作品は、ヒューマン·フロンティア·サイエンス·プログラム助成RGP0024によって資金を供給された。

1。 DNAテンプレートの調製とin vitro転写 <ol><li>興味のある遺伝子はT7および/または例えばSP6転写プロモーターの下に複製されます。 </li><li> in vitro転写用テンプレートDNAは、ORFの終止コドンおよび/ ​​またはmRNAの3 &#39;末端の下流を切断し、適切な制限酵素で直線化されています。一つは、アガロースゲル電気泳動で制限酵素消化製品を実行することにより、プラスミドDNAの完?...

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	<li>Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pause+for+thought+along+the+co-translational+folding+pathway.">A pause for thought along the co-translational folding pathway.</a> Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).</li><li>Sharp, P. M., Cowe, E., Higgins, D. G., Shields, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon+usage+patterns+in+Escherichia+coli,+Bacillus+subtilis,+Saccharomyces+cerevisiae,+Schizosaccharomyces+pombe,+Drosophila+melanogaster+and+Homo+sapiens;+a+review+of+the+considerable+within-species+diversity.">Codon usage patterns in Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Drosophila melanogaster and Homo sapiens; a review of the considerable within-species diversity.</a> Nucleic Acids Res. 16, 8207-8210 (1988).</li><li>Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+differences+in+human+transfer+RNA+expression.">Tissue-specific differences in human transfer RNA expression.</a> PLoS Genet. 2, e221 (2006).</li><li>Ikemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon+usage+and+tRNA+content+in+unicellular+and+multicellular+organisms.">Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms.</a> Mol. Biol. Evol. 2, 13-34 (1985).</li><li>Wolin, S. L., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+pausing+and+stacking+during+translation+of+a+eukaryotic+mRNA.">Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA.</a> EMBO J. 7, 3559-3569 (1998).</li><li>Krasheninnikov, I. A., Komar, A. A., Adzhubei, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonuniform+size+distribution+of+nascent+globin+peptides,+evidence+for+pause+localization+sites,+and+a+cotranslational+protein-folding+model.">Nonuniform size distribution of nascent globin peptides, evidence for pause localization sites, and a cotranslational protein-folding model.</a> J. Protein Chem. 10, 445-454 (1991).</li><li>Komar, A. A., Lesnik, T., Reiss, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synonymous+codon+substitutions+affect+ribosome+traffic+and+protein+folding+during+in+vitro+translation.">Synonymous codon substitutions affect ribosome traffic and protein folding during in vitro translation.</a> FEBS Lett. 462, 387-391 (1999).</li><li>Komar, A. A., Jaenicke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+translation+of+&#947;+B+crystallin+and+its+circularly+permutated+variant+in+an+in+vitro+cell-free+system:+possible+relations+to+codon+distribution+and+protein+folding.">Kinetics of translation of &#947; B crystallin and its circularly permutated variant in an in vitro cell-free system: possible relations to codon distribution and protein folding.</a> FEBS Lett. 376, 195-198 (1995).</li><li>Jha, S., Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth,+life+and+death+of+nascent+polypeptide+chains.">Birth, life and death of nascent polypeptide chains.</a> Biotechnol. J. 6, 623-640 (2011).</li><li>Thanaraj, T. A., Argos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome-mediated+translational+pause+and+protein+domain+organization.">Ribosome-mediated translational pause and protein domain organization.</a> Protein Sci. 5, 1594-1612 (1996).</li><li>Kimchi-Sarfaty, C., Oh, J. M., Kim, I. W., Sauna, Z. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+"silent"+polymorphism+in+the+MDR1+gene+changes+substrate+specificity.">A "silent" polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity.</a> Science. 315, 525-528 (2007).</li><li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricine-sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+proteins+in+the+range+from+1+to+100+kDa.">Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.</a> Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).</li><li>Shirole, N., Balasubramanian, S., Yanofsky, C., Cruz-Vera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Translating+Ribosomes+Containing+Peptidyl-tRNAs+for+Functional+and+Structural+Analyses.">Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses.</a> J. Vis. Exp. (48), e2498 (2011).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li></ol>

再現可能な結果を得るためには、in vitro転写·翻訳反応に使用されるコンポーネントの品質と濃度が非常に重要です。現在の研究では、慎重に処理した場合、再現性の高いデータを提供する市販のキット及び抽出物を使用しています。ただし、必要であれば、翻訳、有能な抽出物は、自分の選択した細胞から調製することができる。 mRNAの品質は翻訳に影響を与えることがないの?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/キットの名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> MEGAscript T7高収率転写キット</td><td> Ambionの</td><td> AM1333 </td></tr><tr><td>リボヌクレアーゼ阻害剤</td><td>インビトロジェン</td><td> 15518012 </td></tr><tr><td>トランス[35 S] -ラベル</td><td> MPのバイオメディカル</td><td> 0151006 </td></tr><tr><td>リボヌクレアーゼ</td><td>インビトロジェン</td><td> 12091 </td></tr><tr><td>ウサギ網状赤血球ライセートシステム、ヌクレアーゼは、治療</td><td>プロメガ</td><td> L4960 </td></tr><tr><td>リニアテンプレートの大腸菌 S30抽出システム</td><td>プロメガ</td><td> L1030 </td></tr><tr><td>遠心分離</td><td>ベックマン·コールター</td><td>オプティマTLX超遠心</td></tr><tr><td>貯蔵燐光体オートラジオグラフY </td><td> GEヘルスケア</td><td>台風9410可変モードイメージャ</td></tr><tr><td>新生ポリペプチド分析用ソフトウェア</td><td> GEヘルスケア</td><td>画像クワントTL、v2005 </td></tr></tbody></table>

isolation of ribosome bound nascent polypeptides in vitro to identify translational pause sites along mrna

翻訳伸長率は、非均一である。二次構造、コドン使用頻度をmRNAと1を参照して 、関連するタンパク質はレビューのためにメッセージにリボソームの動きを変更することがmRNAを。しかし、現在広く同義コドンの使用率が不均一な翻訳伸長率が1の主な原因であることを受け入れている。同義コドンは、同一の周波数で使用されていません。バイアスは、他の2よりも頻繁に使用されるいくつかのコドンを同義コドンの使用に存在しています。コドンバイアスは、生物と同様に2,3 -特定の組織である。また、コドンの使用頻度は、同族のtRNA 4の濃度に直接比例します。したがって、頻繁に使用されるコドンは、さらに頻繁なコドンが速くまれなものよりも翻訳されることを意味し、対応するtRNAの高い多数を持っています。したがって、使用頻度の低いコドン（潜在的な休止サイト）に富んでmRNA上の領域は、原則としてミサにリボソームの動きが遅くなりますそれぞれのサイズ5-8の新生ペプチドのGEの原因と蓄積。これらのポーズのサイトはレビューのために機能的なタンパク質の発現に及ぼす影響は、mRNAの安定性とタンパク質の折りたたみを持っている9を参照することができます。確かに、そのようなポーズサイトの緩和は、mRNAにリボソームの動きを変更することができ、その後、共同翻訳（ インビボ ）タンパク質のフォールディング1,7,10,11の効率に影響を与える可能性があることが示された。最終的には翻訳伸長中のmRNAに沿ってリボソームの移動に関するコドン使用頻度/ tRNAのコンテンツの影響に包括的な洞察を得ることが不可欠であるタンパク質合成のプロセスに結合されている細胞で、 生体内でのタンパク質の折り畳み過程を理解するために、 。 ここでは、様々な無細胞系6-8に翻訳与えられたmRNAの主要な翻訳停止部位を見つけるために使用することができる簡単なテクニックについて説明します。この手順は、新生ポリペプチドaccumulatiの分離に基づいています標的mRNAのin vitro翻訳中のリボソーム上でNG。根拠は、低周波のコドンでは、対応するサイズの新生ペプチドの増加量のリボソーム結果の滞留時間の増加が。in vitroで転写されたmRNA には放射性標識アミノ酸の存在下でin vitroでの翻訳反応に使用されていることです。新生鎖の検出を可能にします。リボソーム結合した新生ポリペプチド複合体を単離するために翻訳反応は、遠心分離に続いて、30％グリセロール溶液の上に階層化されています。ポリソームペレットの新生ポリペプチドはさらにリボヌクレアーゼで処理し、SDS PAGEで解決されます。このテクニックは、潜在的に任意のタンパク質で使用され、リボソームのmRNAに沿って動き、主要な休止部位の検出の分析を可能にすることができます。さらに、このプロトコルは、リボソームの動きを変えることができるので、潜在的にも目を変えることができる要素や条件を研究するために適応させることができます電子機能/タンパク質のコンフォメーション。

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Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

mRNA上の翻訳停止部位を同定する技術が記載されている。この手順は、変性ゲル電気泳動を用いた初期のチェーンの大きさの分析に続いて標的mRNAのin vitro翻訳、イン時にリボソーム上で蓄積新生ポリペプチドの分離に基づいています。

リボソーム結合した新生ポリペプチドの分離<em&gt; in vitroで</em&gt; mRNAに沿って並進一時サイトを識別するために

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

PAR -クリップ - RNA結合タンパク質のトランスクリプトーム全体の結合部位を同定する方法

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

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HeLa細胞のトランスフェクションに続いてGaussiaルシフェラーゼmRNA のインビトロ転写とキャッピングの

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

リボソーム結合したポリペプチドを単離するためのツールと​​してSECM逮捕シーケンスを使用して、

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

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ヒト細胞におけるタンパク質発現の誘導のために修飾されたmRNAのインビトロ合成における

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

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の酸化ストレス抵抗を測定<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt; 96ウェルのマイクロタイタープレート中

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

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Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

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遺伝子を使用するプロトコル設定トランスレーショナルリサーチの適切な動物モデルを識別するために濃縮分析

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

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Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily ...

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