Name: isolation of ribosome bound nascent polypeptides in vitro to identify translational pause sites along mrna
Uploaded: 2012-07-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av Human Frontier Science Program stipend RGP0024.

1. DNA Mal Forberedelse og in vitro Transkripsjon <ol><li> Genet av interesse er klonet etter T7 og / eller f.eks SP6 transcriptional promoter. </li><li> For in vitro transkripsjon malen DNA er lineært med en passende restriksjonsenzym kutte nedstrøms ORF stopp kodon og / eller mRNA 3 &#39;enden. Man trenger å verifisere fullstendig linearisering av plasmid DNA ved å kjøre begrensning fordøyelse produktet på agarose gel elektroforese. </li><li> Den lineær plasmidet brukes til in vitro</em...

<ol>
	<li>Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pause+for+thought+along+the+co-translational+folding+pathway.">A pause for thought along the co-translational folding pathway.</a> Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).</li><li>Sharp, P. M., Cowe, E., Higgins, D. G., Shields, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon+usage+patterns+in+Escherichia+coli,+Bacillus+subtilis,+Saccharomyces+cerevisiae,+Schizosaccharomyces+pombe,+Drosophila+melanogaster+and+Homo+sapiens;+a+review+of+the+considerable+within-species+diversity.">Codon usage patterns in Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Drosophila melanogaster and Homo sapiens; a review of the considerable within-species diversity.</a> Nucleic Acids Res. 16, 8207-8210 (1988).</li><li>Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+differences+in+human+transfer+RNA+expression.">Tissue-specific differences in human transfer RNA expression.</a> PLoS Genet. 2, e221 (2006).</li><li>Ikemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon+usage+and+tRNA+content+in+unicellular+and+multicellular+organisms.">Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms.</a> Mol. Biol. Evol. 2, 13-34 (1985).</li><li>Wolin, S. L., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+pausing+and+stacking+during+translation+of+a+eukaryotic+mRNA.">Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA.</a> EMBO J. 7, 3559-3569 (1998).</li><li>Krasheninnikov, I. A., Komar, A. A., Adzhubei, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonuniform+size+distribution+of+nascent+globin+peptides,+evidence+for+pause+localization+sites,+and+a+cotranslational+protein-folding+model.">Nonuniform size distribution of nascent globin peptides, evidence for pause localization sites, and a cotranslational protein-folding model.</a> J. Protein Chem. 10, 445-454 (1991).</li><li>Komar, A. A., Lesnik, T., Reiss, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synonymous+codon+substitutions+affect+ribosome+traffic+and+protein+folding+during+in+vitro+translation.">Synonymous codon substitutions affect ribosome traffic and protein folding during in vitro translation.</a> FEBS Lett. 462, 387-391 (1999).</li><li>Komar, A. A., Jaenicke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+translation+of+&#947;+B+crystallin+and+its+circularly+permutated+variant+in+an+in+vitro+cell-free+system:+possible+relations+to+codon+distribution+and+protein+folding.">Kinetics of translation of &#947; B crystallin and its circularly permutated variant in an in vitro cell-free system: possible relations to codon distribution and protein folding.</a> FEBS Lett. 376, 195-198 (1995).</li><li>Jha, S., Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth,+life+and+death+of+nascent+polypeptide+chains.">Birth, life and death of nascent polypeptide chains.</a> Biotechnol. J. 6, 623-640 (2011).</li><li>Thanaraj, T. A., Argos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome-mediated+translational+pause+and+protein+domain+organization.">Ribosome-mediated translational pause and protein domain organization.</a> Protein Sci. 5, 1594-1612 (1996).</li><li>Kimchi-Sarfaty, C., Oh, J. M., Kim, I. W., Sauna, Z. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+"silent"+polymorphism+in+the+MDR1+gene+changes+substrate+specificity.">A "silent" polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity.</a> Science. 315, 525-528 (2007).</li><li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricine-sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+proteins+in+the+range+from+1+to+100+kDa.">Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.</a> Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).</li><li>Shirole, N., Balasubramanian, S., Yanofsky, C., Cruz-Vera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Translating+Ribosomes+Containing+Peptidyl-tRNAs+for+Functional+and+Structural+Analyses.">Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses.</a> J. Vis. Exp. (48), e2498 (2011).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li></ol>

For reproduserbare resultater, kvalitet og konsentrasjon av komponentene som brukes for in vitro transkripsjon og oversettelse reaksjoner er kritiske. I denne studien har vi brukt kommersielt tilgjengelige kits og ekstrakter som gir svært reproduserbare data, hvis håndteres forsiktig. Imidlertid kan oversettelse-kompetente ekstrakter være forberedt fra cellen av ens valg, om nødvendig. Kvalitet av mRNA kan påvirke oversettelsen, så det er av største betydning for å teste integriteten til mRNA før du br...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens / Kit </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 høy kapasitet Transcription Kit </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> Ribonuclease Inhibitor </td><td> Invitrogen </td><td> 15518012 </td></tr><tr><td> Trans [35 S]-Label </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0151006 </td></tr><tr><td> Ribonuclease-A </td><td> Invitrogen </td><td> 12091 </td></tr><tr><td> Rabbit reticulocyte lysate System, Behandlet nuklease </td><td> Promega </td><td> L4960 </td></tr><tr><td> E. coli S30 Extract System for Linear Maler </td><td> Promega </td><td> L1030 </td></tr><tr><td> Sentrifugering </td><td> Beckman Coulter </td><td> Optima TLX Ultrasentrifuger </td></tr><tr><td> Lagring fosfor autoradiography </td><td> GE Healthcare </td><td> Typhoon 9410 variabel modus imager </td></tr><tr><td> Programvare for begynnende polypeptid analyse </td><td> GE Healthcare </td><td> Bilde Quant TL, v2005 </td></tr></tbody></table>

isolation of ribosome bound nascent polypeptides in vitro to identify translational pause sites along mrna

Satsen for translatorisk tøyelighet er ikke-uniform. mRNA sekundær struktur, kodon bruk og mRNA tilhørende proteiner kan endre ribosomet bevegelse på meldingen om overprøving se en. Men det er nå allment akseptert at synonymt kodon bruk er den primære årsaken til ikke-uniforme translasjonelle forlengelse priser 1. Synonyme kodon ikke brukes med identisk frekvens. En skjevhet finnes i bruk av synonyme kodon med noen kodon brukes oftere enn andre 2. Kodon skjevhet er organismen samt vev bestemt 2,3. Dessuten er frekvensen av kodon bruk direkte proporsjonal med konsentrasjonen av cognate tRNAs 4. Dermed vil en ofte brukt kodon har høyere mengde tilsvarende tRNAs, noe som ytterligere innebærer at en hyppig kodon vil bli oversatt raskere enn en sjelden en. Dermed vil områder på mRNA anriket i sjeldne kodon (potensiell pause nettsteder) som regel tregere ribosomet bevegelse på Message og årsak akkumulering av begynnende peptider av de respektive størrelser 5-8. Disse pause nettstedene kan ha funksjonell innvirkning på protein uttrykk, mRNA stabilitet og protein folding for vurdering se ni. Faktisk ble det vist at lindring av slike pause nettstedene kan endre ribosomet bevegelse på mRNA og deretter kan påvirke effektiviteten av co-translatorisk (in vivo) proteinfolding 1,7,10,11. For å forstå prosessen med protein folding in vivo, i cellen, som er slutt koblet til prosessen med protein syntese er det viktig å få omfattende innsikt i effekten av kodon bruk / tRNA innhold på bevegelsen av ribosomer langs mRNA under translasjonsforskning tøyelighet . Her beskriver vi en enkel teknikk som kan brukes til å lokalisere større oversettelse pause områder for et gitt mRNA oversatt i ulike celle-frie systemer 6-8. Denne prosedyren er basert på isolasjon av begynnende polypeptider accumulating på ribosomer under in vitro oversettelse av et mål mRNA. Begrunnelsen er at lavfrekvente kodon, økningen i oppholdstid av ribosomene resulterer i økte mengder begynnende peptider av tilsvarende størrelse. In vitro transkribert mRNA brukes til in vitro translasjonelle reaksjoner i nærvær av radioaktivt merket aminosyrer å tillate deteksjon av begynnende kjedene. For å isolere ribosomet innbundne begynnende polypeptid komplekser oversettelsen reaksjonen er lagdelt på toppen av 30% glycerol løsning etterfulgt av sentrifugering. Gryende polypeptider i polysomal pellet er videre behandlet med ribonuklease A og løses av SDS PAGE. Denne teknikken kan potensielt brukes til noe protein og tillater analyse av ribosome bevegelse langs mRNA og påvisning av de store pause nettsteder. I tillegg kan denne protokollen tilpasses studere faktorer og forhold som kan endre ribosomet bevegelse og dermed potensielt kan også endre the funksjon / konformasjon av protein.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA at JoVE.com

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

En teknikk for å identifisere translasjonelle pause områder på mRNA blir beskrevet. Denne prosedyren er basert på isolasjon av begynnende polypeptider samler på ribosomer under in vitro oversettelse av et mål mRNA, etterfulgt av størrelsen analyse av de begynnende kjedene bruker en denaturering gel elektroforese.

Isolering av ribosome Innbundne begynnende polypeptider<em&gt; In vitro</em&gt; For å identifisere translasjonelle Pause steder langs mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transkripsjon og tildekking av Gaussia luciferase mRNA Etterfulgt av Jakten Cell Transfeksjon

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Bruke SecM Arrest sekvens som et verktøy for å isolere ribosom Innbundne polypeptider

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Syntese av Modified mRNA for Induksjon av Protein Expression i humane celler

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Måling Oksidativt stress Resistance of<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; I 96-brønners mikrotiterplater

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Undersøkelse av Proteiner Bundet til begynnende DNA i pattedyrceller Bruke BrdU-chip-Slot-vestlig Technique

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Måle Stivhet<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mus Aorta Bruke Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

En protokoll for bruk av Gene satt berikelse analyse for å identifisere den aktuelle dyr modellen for translasjonsforskning

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

In Vitro SUMOylation analysen å studere SUMO E3 Ligase aktivitet

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rask in Vivo-fiksering og isolering av translasjonskomplekser fra eukaryote celler

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...