Name: isolation of ribosome bound nascent polypeptides in vitro to identify translational pause sites along mrna
Uploaded: 2012-07-06T13:00:00
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Este trabalho foi financiado pelo Programa Ciência das Fronteiras Humanas concessão RGP0024.

1. Preparação de ADN de modelo e transcrição in vitro <ol><li> O gene de interesse é clonado sob T7 e / ou, por exemplo SP6 promotor transcricional. </li><li> Para transcrição in vitro do DNA molde é linearizado com uma enzima de restrição apropriada de corte a jusante do codão de paragem ORF e / ou mRNA extremidade 3 &#39;. Uma das necessidades para verificar a linearização completa do DNA de plasmídeo, executando o produto da digestão de restrição em electroforese...

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	<li>Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pause+for+thought+along+the+co-translational+folding+pathway.">A pause for thought along the co-translational folding pathway.</a> Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).</li><li>Sharp, P. M., Cowe, E., Higgins, D. G., Shields, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon+usage+patterns+in+Escherichia+coli,+Bacillus+subtilis,+Saccharomyces+cerevisiae,+Schizosaccharomyces+pombe,+Drosophila+melanogaster+and+Homo+sapiens;+a+review+of+the+considerable+within-species+diversity.">Codon usage patterns in Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Drosophila melanogaster and Homo sapiens; a review of the considerable within-species diversity.</a> Nucleic Acids Res. 16, 8207-8210 (1988).</li><li>Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+differences+in+human+transfer+RNA+expression.">Tissue-specific differences in human transfer RNA expression.</a> PLoS Genet. 2, e221 (2006).</li><li>Ikemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon+usage+and+tRNA+content+in+unicellular+and+multicellular+organisms.">Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms.</a> Mol. Biol. Evol. 2, 13-34 (1985).</li><li>Wolin, S. L., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+pausing+and+stacking+during+translation+of+a+eukaryotic+mRNA.">Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA.</a> EMBO J. 7, 3559-3569 (1998).</li><li>Krasheninnikov, I. A., Komar, A. A., Adzhubei, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonuniform+size+distribution+of+nascent+globin+peptides,+evidence+for+pause+localization+sites,+and+a+cotranslational+protein-folding+model.">Nonuniform size distribution of nascent globin peptides, evidence for pause localization sites, and a cotranslational protein-folding model.</a> J. Protein Chem. 10, 445-454 (1991).</li><li>Komar, A. 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Biochem. 166, 368-379 (1987).</li><li>Shirole, N., Balasubramanian, S., Yanofsky, C., Cruz-Vera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Translating+Ribosomes+Containing+Peptidyl-tRNAs+for+Functional+and+Structural+Analyses.">Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses.</a> J. Vis. Exp. (48), e2498 (2011).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li></ol>

Para obter resultados reprodutíveis, a qualidade ea concentração dos componentes utilizados para transcrição in vitro e reacções de tradução são críticos. No presente estudo, utilizamos kits disponíveis comercialmente e extratos que fornecem dados altamente reprodutíveis, se manuseados com cuidado. No entanto, a tradução-competentes extractos podem ser preparados a partir da célula da sua escolha, se necessário. Qualidade de ARNm pode afectar a tradução, por isso, é de extrema impor...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome de reagente / Kit </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 Kit de Transcrição de alto rendimento </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> Inibidor da ribonuclease </td><td> Invitrogen </td><td> 15518012 </td></tr><tr><td> Trans [35 S]-Label </td><td> Biomedicals MP </td><td> 0151006 </td></tr><tr><td> Ribonuclease-A </td><td> Invitrogen </td><td> 12091 </td></tr><tr><td> Sistema de Lisado de reticulócitos de coelho, Nuclease Tratada </td><td> Promega </td><td> L4960 </td></tr><tr><td> E. coli S30 Sistema de Extrato de Modelos Lineares </td><td> Promega </td><td> L1030 </td></tr><tr><td> Centrifugação </td><td> Beckman Coulter </td><td> Optima ultracentrífuga TLX </td></tr><tr><td> Armazenamento de fósforo autorradiografiay </td><td> GE Healthcare </td><td> Typhoon 9410 imager modo variável </td></tr><tr><td> Software para análise polipeptídeo nascente </td><td> GE Healthcare </td><td> Imagem Quant TL, v2005 </td></tr></tbody></table>

isolation of ribosome bound nascent polypeptides in vitro to identify translational pause sites along mrna

A taxa de alongamento de translação é não-uniforme. mRNA estrutura secundária, uso de códon mRNA e proteínas associadas podem alterar movimento ribossomo na mensagem para revisão ver 1. No entanto, é agora amplamente aceito que o uso de codons sinônimos é a principal causa da não-uniformes taxas de alongamento de translação 1. Codons sinônimos não são utilizados com freqüência idêntica. Um viés existe no uso de codons sinônimos com alguns códons utilizados com mais freqüência do que os outros 2. Códon viés é organismo, assim como tecidos específicos 2,3. Além disso, a frequência de utilização de codões é directamente proporcional à concentração de tRNAs cognato 4. Assim, um codão frequentemente utilizadas terão maior multiplicidade de tRNAs correspondentes, o que implica ainda que um codão frequente será traduzida mais rápido do que um um pouco frequentes. Assim, as regiões de mRNA enriquecido em códons raros locais (pausa potenciais), regra geral diminuam o movimento ribossomo na message e causa acúmulo de peptídeos nascentes dos respectivos tamanhos 5-8. Estes sites de pausa pode ter impacto funcional sobre a expressão de proteínas, a estabilidade do mRNA e enovelamento de proteínas para revisão ver 9. Com efeito, foi demonstrado que a atenuação dos sítios de pausa tais pode alterar movimento ribossoma em ARNm e, subsequentemente, pode afectar a eficiência da co-translacional enrolamento de proteínas (in vivo) 1,7,10,11. Para compreender o processo de enrolamento de proteínas in vivo, na célula, que é finalmente acoplado ao processo de síntese de proteína que é essencial para obter uma percepção abrangentes para o impacto do codão de conteúdo de uso / tRNA sobre o movimento dos ribossomas ao longo do mRNA durante o alongamento translacional . Descrevemos aqui uma técnica simples que pode ser usado para localizar locais de tradução importantes de pausa para uma dada mRNA traduzido em vários sistemas isentos de células de 6-8. Este procedimento é baseado no isolamento de polipéptidos nascente accumulating em ribossomas durante a tradução in vitro de um mRNA alvo. A razão é que a baixa frequência codões, o aumento no tempo de residência dos resultados ribossomas em quantidades aumentadas de péptidos nascentes dos tamanhos correspondentes. Em mRNA transcrito in vitro é utilizado para reacções de translação in vitro na presença de marcados radioactivamente aminoácidos para permitir a detecção das cadeias nascentes. A fim de isolar bound ribossomas nascentes complexos polipeptídicas a reacção de tradução é em camadas no topo de solução de glicerol a 30%, seguido por centrifugação. Polipéptidos nascente na polissomal pelete são ainda tratadas com ribonuclease A e resolvidos por SDS-PAGE. Esta técnica pode ser potencialmente usada para qualquer proteína e permite a análise de movimento ao longo do mRNA ao ribossoma e à detecção dos sítios de pausa principais. Além disso, este protocolo pode ser adaptado para estudar factores e condições que podem alterar o movimento ribossoma e assim potencialmente também podem alterar the função / conformação da proteína.

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Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Uma técnica para identificar locais de pausa de translação sobre mRNA é descrito. Este procedimento é baseado no isolamento de polipéptidos nascentes que se acumulam nos ribossomas durante in vitro tradução de um ARNm alvo, seguido de análise de tamanho das cadeias nascentes utilizando uma electroforese em gel de desnaturação.

Isolamento de Ribossomos ligados a polipeptídeos nascentes<em&gt; In vitro</em&gt; Identificar Sites Pausa translacionais Junto mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

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JoVE Journal

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