Name: isolation of ribosome bound nascent polypeptides in vitro to identify translational pause sites along mrna
Uploaded: 2012-07-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA at JoVE.com

Detta arbete har finansierats av Human Frontier Science Program bidrag RGP0024.

1. DNA-mall Framställning och in vitro transkription <ol><li> Genen av intresse klonas i T7-och / eller t.ex. SP6 transkriptions-promotor. </li><li> För in vitro transkription av mall-DNA linjäriseras med ett lämpligt restriktionsenzym skärning nedströms ORF stoppkodonet och / eller mRNA-3 &#39;änden. Man måste verifiera fullständig linearisering av plasmid-DNA genom att köra den produkt restriktionsdigerering på agarosgelelektrofores. </li><li> Den linjäriserade plasmiden användes för ...

<ol>
	<li>Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pause+for+thought+along+the+co-translational+folding+pathway.">A pause for thought along the co-translational folding pathway.</a> Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).</li><li>Sharp, P. M., Cowe, E., Higgins, D. G., Shields, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon+usage+patterns+in+Escherichia+coli,+Bacillus+subtilis,+Saccharomyces+cerevisiae,+Schizosaccharomyces+pombe,+Drosophila+melanogaster+and+Homo+sapiens;+a+review+of+the+considerable+within-species+diversity.">Codon usage patterns in Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Drosophila melanogaster and Homo sapiens; a review of the considerable within-species diversity.</a> Nucleic Acids Res. 16, 8207-8210 (1988).</li><li>Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+differences+in+human+transfer+RNA+expression.">Tissue-specific differences in human transfer RNA expression.</a> PLoS Genet. 2, e221 (2006).</li><li>Ikemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon+usage+and+tRNA+content+in+unicellular+and+multicellular+organisms.">Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms.</a> Mol. Biol. Evol. 2, 13-34 (1985).</li><li>Wolin, S. L., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+pausing+and+stacking+during+translation+of+a+eukaryotic+mRNA.">Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA.</a> EMBO J. 7, 3559-3569 (1998).</li><li>Krasheninnikov, I. A., Komar, A. A., Adzhubei, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonuniform+size+distribution+of+nascent+globin+peptides,+evidence+for+pause+localization+sites,+and+a+cotranslational+protein-folding+model.">Nonuniform size distribution of nascent globin peptides, evidence for pause localization sites, and a cotranslational protein-folding model.</a> J. Protein Chem. 10, 445-454 (1991).</li><li>Komar, A. A., Lesnik, T., Reiss, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synonymous+codon+substitutions+affect+ribosome+traffic+and+protein+folding+during+in+vitro+translation.">Synonymous codon substitutions affect ribosome traffic and protein folding during in vitro translation.</a> FEBS Lett. 462, 387-391 (1999).</li><li>Komar, A. A., Jaenicke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+translation+of+&#947;+B+crystallin+and+its+circularly+permutated+variant+in+an+in+vitro+cell-free+system:+possible+relations+to+codon+distribution+and+protein+folding.">Kinetics of translation of &#947; B crystallin and its circularly permutated variant in an in vitro cell-free system: possible relations to codon distribution and protein folding.</a> FEBS Lett. 376, 195-198 (1995).</li><li>Jha, S., Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth,+life+and+death+of+nascent+polypeptide+chains.">Birth, life and death of nascent polypeptide chains.</a> Biotechnol. J. 6, 623-640 (2011).</li><li>Thanaraj, T. A., Argos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome-mediated+translational+pause+and+protein+domain+organization.">Ribosome-mediated translational pause and protein domain organization.</a> Protein Sci. 5, 1594-1612 (1996).</li><li>Kimchi-Sarfaty, C., Oh, J. M., Kim, I. W., Sauna, Z. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+"silent"+polymorphism+in+the+MDR1+gene+changes+substrate+specificity.">A "silent" polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity.</a> Science. 315, 525-528 (2007).</li><li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricine-sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+proteins+in+the+range+from+1+to+100+kDa.">Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.</a> Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).</li><li>Shirole, N., Balasubramanian, S., Yanofsky, C., Cruz-Vera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Translating+Ribosomes+Containing+Peptidyl-tRNAs+for+Functional+and+Structural+Analyses.">Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses.</a> J. Vis. Exp. (48), e2498 (2011).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li></ol>

För reproducerbara resultat, kvalitet och koncentrationen av de komponenter som används för in vitro transkriptions-och translationsreaktioner är kritiska. I den aktuella studien har vi använt kommersiellt tillgängliga kit och extrakt som ger mycket reproducerbara data, om den hanteras varsamt. Emellertid kan översättning-kompetenta extrakt framställas från cellen av en val, om så behövs. Kvalitet av mRNA kan påverka translation, så är det av yttersta vikt för att testa integriteten hos mRNA inn...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn på reagens / Kit </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 Hög avkastning Transkription Kit </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> Ribonukleasinhibitor </td><td> Invitrogen </td><td> 15518012 </td></tr><tr><td> Träns [35S]-Tillverkare </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0151006 </td></tr><tr><td> Ribonukleas A </td><td> Invitrogen </td><td> 12.091 </td></tr><tr><td> Kaninretikulocytlysat System Behandlad Nukleas </td><td> Promega </td><td> L4960 </td></tr><tr><td> E. coli S30 extrakt System för linjära mallar </td><td> Promega </td><td> L1030 </td></tr><tr><td> Centrifugering </td><td> Beckman Coulter </td><td> Optima TLX ultracentrifug </td></tr><tr><td> Lagring fosforen autoradiografy </td><td> GE Healthcare </td><td> Typhoon 9410 variabel läge avbildare </td></tr><tr><td> Programvara för begynnande polypeptid analys </td><td> GE Healthcare </td><td> Image Quant TL, v2005 </td></tr></tbody></table>

isolation of ribosome bound nascent polypeptides in vitro to identify translational pause sites along mrna

Hastigheten för translationella töjning är olikformig. mRNA sekundär struktur, kodon användning och mRNA associerade proteiner kan förändra ribosomen rörelse på meddelandet för översikt se 1. Men det är nu allmänt accepterat att synonymt kodon användning är den främsta orsaken till icke-enhetliga translationella förlängning priser 1. Synonyma kodon används inte med samma frekvens. En förspänning existerar i användningen av synonyma kodon med vissa kodoner som används mer frekvent än andra 2. Kodon fördomar är organism, liksom vävnadsspecifik 2,3. Dessutom är frekvensen av kodonanvändning direkt proportionell mot koncentrationen av kognat-tRNA-sekvenser 4. Således kommer en ofta använd kodon har högre mängd motsvarande tRNA, vilket ytterligare innebär att en frekvent kodon kommer att översättas snabbare än en sällan en. Således kommer regionerna på mRNA anrikas i sällsynta kodon (potentiella paus platser) som regel långsammare ribosomen rörelse på messaGE och orsaka ackumulering av halvfärdiga peptiderna för de respektive storlekarna 5-8. Dessa paus webbplatser kan ha funktionell påverkan på protein expression, mRNA stabilitet och protein folding för översikt se 9. I själva verket visade det sig att lindra dessa paus webbplatser kan förändra ribosomen rörelse på mRNA och därefter kan påverka effektiviteten av sam-translationell (in vivo) proteinveckning 1,7,10,11. För att förstå processen för proteinveckning in vivo, i cellen, som slutligen är kopplad till processen att proteinsyntesen är det viktigt att få omfattande insikt i effekterna av kodonanvändningen / tRNA innehåll på den fria rörligheten för ribosomer längs mRNA under translationell förlängning . Här beskriver vi en enkel teknik som kan användas för att lokalisera viktiga platser översättning paus för en viss mRNA översätts i olika cellfria system 6-8. Detta förfarande grundar sig på isolering av begynnande polypeptider accumulating på ribosomer under in vitro-translation av en mål-mRNA. Den logiska grunden är att vid låga frekvenser kodoner, ökningen i uppehållstiden för ribosomer resulterar i ökade mängder av halvfärdiga peptiderna av de motsvarande storlek. In vitro transkriberade mRNA används för in vitro translationella reaktioner i närvaro av radioaktivt märkta aminosyror för att tillåta detektering av de begynnande kedjorna. För att isolera ribosom bundna begynnande polypep-komplex i translationsreaktionen skiktas på toppen av 30% glycerol-lösning följt av centrifugering. Begynnande polypeptider i Polysomalt pellet ska fortsätta behandlas med ribonukleas A och lösas genom SDS-PAGE. Denna teknik kan potentiellt användas för något protein och medger analys av ribosomen rörelse längs mRNA och detektering av de stora paus ställen. Dessutom kan detta protokoll anpassas för att studera faktorer och förhållanden som kan förändra ribosomen rörelse och därmed potentiellt kan också förändra the funktion / konformation av proteinet.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA at JoVE.com

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

En teknik för att identifiera translationella pausa platser på mRNA beskrivs. Detta förfarande grundar sig på isolering av begynnande polypeptider som samlas på ribosomer under in vitro-translation av en mål-mRNA, följt av storleksanalys av begynnande kedjorna med användning av en denaturerande gel-elektrofores.

Isolering av ribosom Bundna framväxande Polypeptider<em&gt; In vitro</em&gt; För att identifiera Translationell Paus webbplatser Längs mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

PAR-Clip - En metod för att identifiera transkriptom hela bindningar på RNA-proteiner

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transkription och begränsning av Gaussia Luciferas mRNA Följt av HeLa celltransfektion

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Använda SecM Arrest sekvens som ett verktyg för Isolera ribosom Bundna Polypeptider

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In vitro Syntes av modifierade mRNA för induktion av proteinuttryck i humana celler

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Mätning Oxidativ stress Resistans<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; I 96-brunnars mikrotiterplattor

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Granskning av proteiner bundna till Nascent DNA i däggdjursceller med användning BrdU-Chip-Slot-Western Teknik

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Mätning av styvheten hos<em&gt; Ex vivo</em&gt; Mus Aorta Använda atomkraftsmikroskopi

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Ett protokoll för att använda gen Set-anrikning analys identifiera den lämplig djurmodell för translationell forskning

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

In Vitro SUMOylation Assay att studera SUMO E3 Ligase aktivitet

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Snabb in vivo-fixering och isolering av translationella komplex från eukaryota celler

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...