Name: using secm arrest sequence as a tool to isolate ribosome bound polypeptides
Uploaded: 2012-06-19T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pelo Programa Ciência das Fronteiras Humanas concessão RGP0024.

1. Preparação de ADN de modelo e transcrição in vitro <ol><li> O gene de interesse é clonado em qualquer e T7 / ou, por exemplo SP6 promotor baseado plasmídeo. Para obter RNC de interesse, C-terminal do polipéptido alvo é estendido por adição de sequência de captura indutor do SECM FXXXXWIXXXXGIRAGP 7. A fim de assegurar que o fragmento de polipéptido de interesse será extrudir para fora do túnel ribossomal, a parte C-terminal da proteína alvo deve ser ampliada de pelo menos...

<ol>
	<li>Fedorov, A. N., Baldwin, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+protein+folding.">Cotranslational protein folding.</a> J. Biol. Chem. 272, 32715-32718 (1997).</li><li>Hardesty, B., Kramer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+a+nascent+peptide+on+the+ribosome.">Folding of a nascent peptide on the ribosome.</a> Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66, 41-66 (2001).</li><li>Kramer, G., Boehringer, D., Ban, N., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+as+a+platform+for+co-translational+processing,+folding+and+targeting+of+newly+synthesized+proteins.">The ribosome as a platform for co-translational processing, folding and targeting of newly synthesized proteins.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 589-597 (2009).</li><li>Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pause+for+thought+along+the+co-translational+folding+pathway.">A pause for thought along the co-translational folding pathway.</a> Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).</li><li>Cabrita, L. D., Dobson, C. M., Christodoulou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+on+the+ribosome.">Protein folding on the ribosome.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 20, 33-45 (2010).</li><li>Oliver, D., Norman, J., Sarker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Escherichia+coli+secA+by+cellular+protein+secretion+proficiency+requires+an+intact+gene+X+signal+sequence+and+an+active+translocon.">Regulation of Escherichia coli secA by cellular protein secretion proficiency requires an intact gene X signal sequence and an active translocon.</a> J. Bacteriol. 180, 5240-5242 (1998).</li><li>Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosomal+exit+tunnel+functions+as+a+discriminating+gate.">The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate.</a> Cell. 108, 629-636 (2002).</li><li>Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+monitor,+SecM,+undergoes+self-translation+arrest+in+the+cytosol.">Secretion monitor, SecM, undergoes self-translation arrest in the cytosol.</a> Mol. Cell. 7, 185-192 .</li><li>Muto, H., Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+but+non+polypeptide+prolyl-tRNA+functions+in+the+A+site+for+SecM-mediated+ribosomal+stall.">Genetically encoded but non polypeptide prolyl-tRNA functions in the A site for SecM-mediated ribosomal stall.</a> Mol. Cell. 22, 545-552 (2006).</li><li>Cabrita, L. D., Hsu, S. T., Launay, H., Dobson, C. M., Christodoulou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+ribosome-nascent+chain+complexes+produced+in+vivo+by+NMR+spectroscopy.">Probing ribosome-nascent chain complexes produced in vivo by NMR spectroscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22239-22244 (2009).</li><li>Eichmann, C., Preissler, S., Riek, R., Deuerling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+structure+acquisition+of+nascent+polypeptides+monitored+by+NMR+spectroscopy.">Cotranslational structure acquisition of nascent polypeptides monitored by NMR spectroscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 9111-9116 (2010).</li><li>Kolb, V. A., Makeyev, E. V., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+activity+of+the+ribosome-bound+nascent+polypeptide.">Enzymatic activity of the ribosome-bound nascent polypeptide.</a> FEBS Lett. 378, 166-170 (1996).</li><li>Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+atomic+structure+of+the+large+ribosomal+subunit+at+2.4+Å+resolution.">The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution.</a> Science. 289, 905-920 (2000).</li><li>Voss, N. R., Gerstein, M., Steitz, T. A., Moore, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+geometry+of+the+ribosomal+polypeptide+exit+tunnel.">The geometry of the ribosomal polypeptide exit tunnel.</a> J. Mol. Biol. 360, 893-906 (2006).</li><li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricine-sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+proteins+in+the+range+from+1+to+100+kDa.">Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.</a> Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).</li><li>Komar, A. A., Kommer, A., Krasheninnikov, I. A., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+folding+of+globin.">Cotranslational folding of globin.</a> J. Biol. Chem. 272, 10646-10651 (1997).</li><li>Keiler, K. C., Waller, P. R., Sauer, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+a+peptide+tagging+system+in+degradation+of+proteins+synthesized+from+damaged+messenger+RNA.">Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA.</a> Science. 271, 990-993 (1996).</li><li>Evans, M. S., Ugrinov, K. G., Frese, M. A., Clark, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+stalled+ribosome+nascent+chain+complexes+produced+in+vivo+or+in+vitro.">Homogeneous stalled ribosome nascent chain complexes produced in vivo or in vitro.</a> Nat. Methods. 2, 757-762 (2005).</li></ol>

Para obter resultados reprodutíveis, a qualidade ea concentração dos componentes utilizados para transcrição in vitro e tradução são críticos. Usámos comercialmente disponível in vitro transcrição e extractos de tradução e dão resultados reprodutíveis e eficientes, se manuseados com cuidado. Qualidade de ARNm pode afectar a tradução, por isso, é de extrema importância para testar a integridade do mRNA antes de o utilizar para tradução in vitro. Tempo de...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome de reagente / Kit </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 Kit de Transcrição de alto rendimento </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> RTS 100 E.coli HY Kit </td><td> 5 Prime </td><td> 2401100 </td></tr><tr><td> Inibidor da ribonuclease </td><td> Invitrogen </td><td> 15518012 </td></tr><tr><td> Trans [35 S]-Label </td><td> Biomedicals MP </td><td> 0151006 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-4 unitário Centrífuga filtro </td><td> Millipore </td><td> UFC801008 </td></tr><tr><td> Armazenamento de fósforo autoradiografia </td><td> GE Healthcare </td><td> Typhoon 9410 imager modo variável </td></tr><tr><td> Densidade Sistemas de Fracionamento Gradiente </td><td> Teledyne Isco, Inc. </td><td> ISCO Sistema Gradiente programável Densidade </td></tr><tr><td> Sacarose Gradiente Centrifugation </td><td> Beckman Coulter </td><td> Optima L-90 K ultracentrífuga Preparativo </td></tr></tbody></table>

using secm arrest sequence as a tool to isolate ribosome bound polypeptides

A pesquisa extensiva tem forneceram evidências que sugerem que a proteína amplos dobrando na célula é um processo de co-translacional 1-5. No entanto, o caminho exato que cadeia polipeptídica segue durante a co-traducional dobrar para atingir sua forma funcional ainda é um enigma. A fim de compreender este processo e para determinar a conformação exacta dos intermediários de co-translacionais de dobragem, é essencial ao desenvolvimento de técnicas que permitem o isolamento de RNC que transportam cadeias nascentes de tamanhos pré-determinados para permitir a sua posterior análise estrutural. SECM (monitor secreção) é um aminoácido 170 E. coli proteína que regula a expressão do jusante SecA ATPase (condução secreção) no operão SECM-seca 6. Nakatogawa e Ito originalmente descobriu que uma sequência de aminoácidos 17 de comprimento (150-FSTPVWISQA QGIRA G P-166) na região C-terminal da proteína SECM são necessários e suficientes paracausar bloqueamento dos alongamento SECM em Gly165, produzindo assim peptidil-glicil-tRNA estavelmente ligado ao ribossoma P-site 7-9. Mais importante, verificou-se que esta sequência de aminoácidos 17 de comprimento pode ser fundido com o terminal C de virtualmente qualquer proteína de comprimento completo e / ou truncado, permitindo assim a produção de RNC que transportam cadeias nascentes de tamanhos pré-determinados 7. Assim, quando fundidos ou inserida na proteína alvo, SECM sequência stalling produz prisão do alongamento da cadeia polipeptídica e gera RNC estáveis ​​tanto in vivo em E. células de Escherichia e in vitro num sistema isento de células. Centrifugação em gradiente de sacarose é ainda utilizado para isolar RNC. Os RNC isolados podem ser utilizados para analisar as características estruturais e funcionais dos intermediários de co-translacionais dobráveis. Recentemente, esta técnica tem sido usada com sucesso para obter insights sobre a estrutura de vários ribossomas ligados a cadeias nascentes 10,11. Aqui nós descrevemos o isolamento de bovinos Gamma-B cristalina RNCS fundido a SECM e gerado em um sistema de tradução in vitro.

Watch this Scientific Journal Video about Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides at JoVE.com

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides (Video) | JoVE

Descrevemos aqui uma técnica que é rotineiramente usado para isolar estavelmente ligados ribossomo complexos da cadeia nascente (RNC). Esta técnica aproveita a descoberta de que um jovem de 17 aminoácidos longo SECM &quot;seqüência de prisão&quot; pode parar de alongamento de tradução em uma procariótica (<em&gt; E. coli</em&gt;) Do sistema, quando inseridos em (ou fundido com o terminal C) de virtualmente qualquer proteína.

Usando Seqüência de Detenção SECM como uma ferramenta para isolar Ribossomos Polipeptídeos encadernados

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Research

JoVE Journal

Biology

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces

Microfabricated Post-Array-Detectors mPADs: an Approach to Isolate Mechanical Forces (Video) | JoVE

Microfabricated Pós-Array-detectores (mPADs): uma abordagem para isolar Forças Mecânica

In this video, we will present our approach to measure cellular traction forces using a microfabricated array of posts.  Traction forces are generated ...

Biologia

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets (Video) | JoVE

Microscópio óptico e Eletrônica (CLEM) como uma ferramenta para visualizar moléculas microinjetados e seus eucarióticas Sub-celulares Metas


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles (Video) | JoVE

Bioensaio eletroantenográfica como uma ferramenta de triagem para voláteis da planta hospedeira

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA (Video) | JoVE

Isolamento de Ribossomos ligados a polipeptídeos nascentes<em&gt; In vitro</em&gt; Identificar Sites Pausa translacionais Junto mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism (Video) | JoVE

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique (Video) | JoVE

Exame de proteínas ligadas ao DNA em células de mamíferos Nascente usar a técnica de-BrdU-chip-Slot Ocidental

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types (Video) | JoVE

assistida por laser Microdissecção (LAM) como ferramenta para transcricional Profiling de tipos de células individuais

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model (Video) | JoVE

Magnético-ativado da pilha classificação estratégias para isolar e purificar sinovial fluidos derivados mesenquimais células-tronco de um modelo de coelho

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse (Video) | JoVE

Um método de alta saída para isolar pericites cerebrais do rato

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...

Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles (Video) | JoVE

Sequenciamento transposon-inserção como uma ferramenta para elucidar fatores de colonização bacteriana em um Birkholderia gladioli Simbionte de Besouros Lagria villosa

Inferring the function of genes by manipulating their activity is an essential tool for understanding the genetic underpinnings of most biological ...