Name: using secm arrest sequence as a tool to isolate ribosome bound polypeptides
Uploaded: 2012-06-19T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides at JoVE.com

Эта работа финансировалась по программе по науке пограничной грант RGP0024.

1. Подготовка шаблона ДНК и транскрипции в пробирке <ol><li> Гена, клонируют в любом T7 и / или, например, SP6 промоутер основана плазмиды. Для получения КРС интерес, С-конца полипептидной целевой расширенной арест вызывающие последовательности МЭСМ FXXXXWIXXXXGIRAGP 7. Для того, чтобы убеди...

<ol>
	<li>Fedorov, A. N., Baldwin, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+protein+folding.">Cotranslational protein folding.</a> J. Biol. Chem. 272, 32715-32718 (1997).</li><li>Hardesty, B., Kramer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+a+nascent+peptide+on+the+ribosome.">Folding of a nascent peptide on the ribosome.</a> Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66, 41-66 (2001).</li><li>Kramer, G., Boehringer, D., Ban, N., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+as+a+platform+for+co-translational+processing,+folding+and+targeting+of+newly+synthesized+proteins.">The ribosome as a platform for co-translational processing, folding and targeting of newly synthesized proteins.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 589-597 (2009).</li><li>Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pause+for+thought+along+the+co-translational+folding+pathway.">A pause for thought along the co-translational folding pathway.</a> Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).</li><li>Cabrita, L. D., Dobson, C. M., Christodoulou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+on+the+ribosome.">Protein folding on the ribosome.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 20, 33-45 (2010).</li><li>Oliver, D., Norman, J., Sarker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Escherichia+coli+secA+by+cellular+protein+secretion+proficiency+requires+an+intact+gene+X+signal+sequence+and+an+active+translocon.">Regulation of Escherichia coli secA by cellular protein secretion proficiency requires an intact gene X signal sequence and an active translocon.</a> J. Bacteriol. 180, 5240-5242 (1998).</li><li>Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosomal+exit+tunnel+functions+as+a+discriminating+gate.">The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate.</a> Cell. 108, 629-636 (2002).</li><li>Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+monitor,+SecM,+undergoes+self-translation+arrest+in+the+cytosol.">Secretion monitor, SecM, undergoes self-translation arrest in the cytosol.</a> Mol. Cell. 7, 185-192 .</li><li>Muto, H., Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+but+non+polypeptide+prolyl-tRNA+functions+in+the+A+site+for+SecM-mediated+ribosomal+stall.">Genetically encoded but non polypeptide prolyl-tRNA functions in the A site for SecM-mediated ribosomal stall.</a> Mol. Cell. 22, 545-552 (2006).</li><li>Cabrita, L. D., Hsu, S. T., Launay, H., Dobson, C. M., Christodoulou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+ribosome-nascent+chain+complexes+produced+in+vivo+by+NMR+spectroscopy.">Probing ribosome-nascent chain complexes produced in vivo by NMR spectroscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22239-22244 (2009).</li><li>Eichmann, C., Preissler, S., Riek, R., Deuerling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+structure+acquisition+of+nascent+polypeptides+monitored+by+NMR+spectroscopy.">Cotranslational structure acquisition of nascent polypeptides monitored by NMR spectroscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 9111-9116 (2010).</li><li>Kolb, V. A., Makeyev, E. V., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+activity+of+the+ribosome-bound+nascent+polypeptide.">Enzymatic activity of the ribosome-bound nascent polypeptide.</a> FEBS Lett. 378, 166-170 (1996).</li><li>Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+atomic+structure+of+the+large+ribosomal+subunit+at+2.4+Å+resolution.">The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution.</a> Science. 289, 905-920 (2000).</li><li>Voss, N. R., Gerstein, M., Steitz, T. A., Moore, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+geometry+of+the+ribosomal+polypeptide+exit+tunnel.">The geometry of the ribosomal polypeptide exit tunnel.</a> J. Mol. Biol. 360, 893-906 (2006).</li><li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricine-sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+proteins+in+the+range+from+1+to+100+kDa.">Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.</a> Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).</li><li>Komar, A. A., Kommer, A., Krasheninnikov, I. A., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+folding+of+globin.">Cotranslational folding of globin.</a> J. Biol. Chem. 272, 10646-10651 (1997).</li><li>Keiler, K. C., Waller, P. R., Sauer, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+a+peptide+tagging+system+in+degradation+of+proteins+synthesized+from+damaged+messenger+RNA.">Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA.</a> Science. 271, 990-993 (1996).</li><li>Evans, M. S., Ugrinov, K. G., Frese, M. A., Clark, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+stalled+ribosome+nascent+chain+complexes+produced+in+vivo+or+in+vitro.">Homogeneous stalled ribosome nascent chain complexes produced in vivo or in vitro.</a> Nat. Methods. 2, 757-762 (2005).</li></ol>

Для воспроизводимости результатов, качества и концентрации компонентов, используемых для транскрипции в пробирке и перевод являются критическими. Мы использовали коммерчески доступные в пробирке транскрипции и трансляции выдержки, и они дают эффективные и воспроизводимые...

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента / Kit </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 Высокая доходность Kit Транскрипция </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> РТС 100 E.coli HY Kit </td><td> 5 премьер </td><td> 2401100 </td></tr><tr><td> Ингибитор рибонуклеазы </td><td> Invitrogen </td><td> 15518012 </td></tr><tr><td> Транс [35 S]-Label </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0151006 </td></tr><tr><td> Amicon Ультра-4 центробежного фильтра группы </td><td> Millipore </td><td> UFC801008 </td></tr><tr><td> Хранение фосфор авторадиографии </td><td> GE Healthcare </td><td> Тайфун 9410 изображений в режиме переменной </td></tr><tr><td> Плотность системы Градиент фракционирования </td><td> Teledyne Isco, Inc </td><td> ISCO Программируемая система градиента плотности </td></tr><tr><td> Градиенте сахарозы Centrifugation </td><td> Beckman Coulter </td><td> Optima L-90 К препаративной ультрацентрифуге </td></tr></tbody></table>

using secm arrest sequence as a tool to isolate ribosome bound polypeptides

Обширное исследование предоставило достаточно доказательств предположить, что сворачивание белков в клетке является одним из поступательного процесса 1-5. Тем не менее, точный путь, который полипептидной цепи следует во время совместного поступательного складные для достижения функциональной форме, остается загадкой. Для того чтобы понять этот процесс и определить точную конформацию совместного поступательного складной промежуточные, важно разработать методы, которые позволяют изоляции КРС проведение зарождающейся цепи заданные размеры, чтобы их дальнейшего структурного анализа. МЭСМ (секреция монитор) составляет 170 аминокислот E. палочки белок, который регулирует экспрессию вниз Seca (секреция езды) АТФазы в МЭСМ-Сека оперона 6. Nakatogawa и Ито первоначально установлено, что 17 аминокислот длинной последовательности (150-FSTPVWISQA QGIRA G P-166) в C-концевой области белка МЭСМ является достаточным и необходимымвызвать срыв удлинения МЭСМ в Gly165, таким образом производя пептидил-глицил-тРНК стабильно связан с рибосомных Р-сайт 7-9. Более того, выяснилось, что это 17 аминокислот длинной последовательности могут быть слиты с С-конца практически любого полнометражных и / или усеченный белок позволяя производство КРС проведение зарождающейся цепи заданные размеры 7. Таким образом, когда сливаются или вставляется в целевой белок, МЭСМ срыва последовательность производит арест полипептид удлинение цепи и генерирует стабильный КРС как в естественных условиях в E. кишечной клетки в пробирке и в бесклеточной системе. Центрифугирование градиента сахарозы в дальнейшем используются для изоляции RNC. Изолированной КРС может быть использована для анализа структурных и функциональных особенностей совместного поступательного складной промежуточных продуктов. В последнее время эта методика была успешно использована для получения взглянуть на структуру рибосомы несколько связанных зарождающейся цепи 10,11. Здесь мы описываем изоляции бычьего гамма-B кристаллина КРС слит с МЭСМ и сформированных в системе перевода в пробирке.

Watch this Scientific Journal Video about Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides at JoVE.com

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Здесь мы опишем технику, которая в настоящее время обычно используется для изоляции стабильно связанного рибосомы зарождающейся цепных комплексов (КРС). Эта техника использует открытие, что 17 аминокислот долго МЭСМ &quot;арест последовательность&quot; может остановить элонгации трансляции в прокариотических (<em&gt; E. палочки</em&gt;) Системы, когда вставляется (или слит с С-конца) практически любых белков.

Использование МЭСМ последовательности арест как средство изолировать Рибосома связанных полипептидов

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces

Microfabricated Post-Array-Detectors mPADs: an Approach to Isolate Mechanical Forces

Сообщение Microfabricated-Array-детекторы (ПЗРК): Подход к изолят механических сил

In this video, we will present our approach to measure cellular traction forces using a microfabricated array of posts.  Traction forces are generated ...

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

Корреляционный световой и электронной микроскопии (CLEM) как инструмент для визуализации микроинъекции молекул и их Эукариотические Sub-клеточных мишеней


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Electroantennographic биопроб в качестве скринингового инструмента для летучих растения-хозяина

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Выделение Рибосома связанных стадии становления Полипептиды<em&gt; В пробирке</em&gt;, Чтобы определить Поступательное сайтов Пауза Наряду мРНК

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Экспертиза белков, связанных с ДНК находятся в стадии становления в клетках млекопитающих, используя BrdU-чип-Slot-Западная Техника

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Помощью лазера микродиссекция (LAM) в качестве инструмента для транскрипционные Профилирование отдельных типов клеток

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Магнитные активированный ячейку Сортировка стратегии изоляции и очищают синовиальной жидкости производные мезенхимальных стволовых клеток из кролика модели

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

Высокий метод выхода для изоляции церебральных перицитов от мыши

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...

Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

Транспозонно-инстиционное секвенирование как инструмент для выяснения факторов бактериальной колонизации у гладиолусов Burkholderia Симбионт Жуков Lagria villosa

Inferring the function of genes by manipulating their activity is an essential tool for understanding the genetic underpinnings of most biological ...