Name: using secm arrest sequence as a tool to isolate ribosome bound polypeptides
Uploaded: 2012-06-19T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides at JoVE.com

Detta arbete har finansierats av Human Frontier Science Program bidrag RGP0024.

1. DNA-mall Framställning och in vitro transkription <ol><li> Genen av intresse klonas i någon T7 och / eller t.ex. SP6-promotorn baserad plasmid. För att erhålla RNC av intresse, är C-terminalen av målpolypeptiden förlängas genom att lägga till sekvensen gripande inducerande av SecM FXXXXWIXXXXGIRAGP 7. För att säkerställa att polypeptiden fragmentet av intresse kommer extrudera ut ur ribosomala tunneln har den C-terminala delen av mål-proteinet som skall förlängas med minst 30 amin...

<ol>
	<li>Fedorov, A. N., Baldwin, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+protein+folding.">Cotranslational protein folding.</a> J. Biol. Chem. 272, 32715-32718 (1997).</li><li>Hardesty, B., Kramer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+a+nascent+peptide+on+the+ribosome.">Folding of a nascent peptide on the ribosome.</a> Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66, 41-66 (2001).</li><li>Kramer, G., Boehringer, D., Ban, N., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+as+a+platform+for+co-translational+processing,+folding+and+targeting+of+newly+synthesized+proteins.">The ribosome as a platform for co-translational processing, folding and targeting of newly synthesized proteins.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 589-597 (2009).</li><li>Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pause+for+thought+along+the+co-translational+folding+pathway.">A pause for thought along the co-translational folding pathway.</a> Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).</li><li>Cabrita, L. D., Dobson, C. M., Christodoulou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+on+the+ribosome.">Protein folding on the ribosome.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 20, 33-45 (2010).</li><li>Oliver, D., Norman, J., Sarker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Escherichia+coli+secA+by+cellular+protein+secretion+proficiency+requires+an+intact+gene+X+signal+sequence+and+an+active+translocon.">Regulation of Escherichia coli secA by cellular protein secretion proficiency requires an intact gene X signal sequence and an active translocon.</a> J. Bacteriol. 180, 5240-5242 (1998).</li><li>Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosomal+exit+tunnel+functions+as+a+discriminating+gate.">The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate.</a> Cell. 108, 629-636 (2002).</li><li>Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+monitor,+SecM,+undergoes+self-translation+arrest+in+the+cytosol.">Secretion monitor, SecM, undergoes self-translation arrest in the cytosol.</a> Mol. Cell. 7, 185-192 .</li><li>Muto, H., Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+but+non+polypeptide+prolyl-tRNA+functions+in+the+A+site+for+SecM-mediated+ribosomal+stall.">Genetically encoded but non polypeptide prolyl-tRNA functions in the A site for SecM-mediated ribosomal stall.</a> Mol. Cell. 22, 545-552 (2006).</li><li>Cabrita, L. D., Hsu, S. T., Launay, H., Dobson, C. M., Christodoulou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+ribosome-nascent+chain+complexes+produced+in+vivo+by+NMR+spectroscopy.">Probing ribosome-nascent chain complexes produced in vivo by NMR spectroscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22239-22244 (2009).</li><li>Eichmann, C., Preissler, S., Riek, R., Deuerling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+structure+acquisition+of+nascent+polypeptides+monitored+by+NMR+spectroscopy.">Cotranslational structure acquisition of nascent polypeptides monitored by NMR spectroscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 9111-9116 (2010).</li><li>Kolb, V. A., Makeyev, E. V., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+activity+of+the+ribosome-bound+nascent+polypeptide.">Enzymatic activity of the ribosome-bound nascent polypeptide.</a> FEBS Lett. 378, 166-170 (1996).</li><li>Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+atomic+structure+of+the+large+ribosomal+subunit+at+2.4+Å+resolution.">The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution.</a> Science. 289, 905-920 (2000).</li><li>Voss, N. R., Gerstein, M., Steitz, T. A., Moore, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+geometry+of+the+ribosomal+polypeptide+exit+tunnel.">The geometry of the ribosomal polypeptide exit tunnel.</a> J. Mol. Biol. 360, 893-906 (2006).</li><li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricine-sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+proteins+in+the+range+from+1+to+100+kDa.">Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.</a> Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).</li><li>Komar, A. A., Kommer, A., Krasheninnikov, I. A., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+folding+of+globin.">Cotranslational folding of globin.</a> J. Biol. Chem. 272, 10646-10651 (1997).</li><li>Keiler, K. C., Waller, P. R., Sauer, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+a+peptide+tagging+system+in+degradation+of+proteins+synthesized+from+damaged+messenger+RNA.">Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA.</a> Science. 271, 990-993 (1996).</li><li>Evans, M. S., Ugrinov, K. G., Frese, M. A., Clark, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+stalled+ribosome+nascent+chain+complexes+produced+in+vivo+or+in+vitro.">Homogeneous stalled ribosome nascent chain complexes produced in vivo or in vitro.</a> Nat. Methods. 2, 757-762 (2005).</li></ol>

För reproducerbara resultat, kvalitet och koncentrationen av de komponenter som används för in vitro transkription och translation är kritiska. Vi har använt kommersiellt tillgängliga in vitro transkription och extrakt översättning och de ger effektiva och reproducerbara resultat, om den hanteras varsamt. Kvaliteten på mRNA kan påverka översättningen, så det är av yttersta vikt att testa integritet mRNA innan du använder den för in vitro translation. Inkubationstiden för i...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn på reagens / Kit </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 Hög avkastning Transkription Kit </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> RTS 100 E. coli HY Kit </td><td> 5 Prime </td><td> 2401100 </td></tr><tr><td> Ribonukleasinhibitor </td><td> Invitrogen </td><td> 15518012 </td></tr><tr><td> Träns [35S]-Tillverkare </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0151006 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-4 centrifugalfilter Unit </td><td> Millipore </td><td> UFC801008 </td></tr><tr><td> Lagring fosforen autoradiografi </td><td> GE Healthcare </td><td> Typhoon 9410 variabel läge avbildare </td></tr><tr><td> Densitet gradientfraktionering Systems </td><td> Teledyne Isco, Inc. </td><td> ISCO programmerbara Densitet Gradient System </td></tr><tr><td> Sackarosgradient Centrifugation </td><td> Beckman Coulter </td><td> Optima L-90 K Preparativt ultracentrifug </td></tr></tbody></table>

using secm arrest sequence as a tool to isolate ribosome bound polypeptides

Omfattande forskning har gett gott om bevis som tyder på att protein vika i cellen är ett samarbete translationell process 1-5. Men är den exakta väg som polypeptidkedja följer vid samtidig translationell vikning för att uppnå funktionell form fortfarande en gåta. För att förstå denna process och att bestämma den exakta utformningen av de sam-translationella hopfällbara intermediärer, är det viktigt att utveckla tekniker som gör det möjligt isolering av RNC bär begynnande kedjor av förutbestämda storlek att de kan ytterligare strukturella analys. SecM (utsöndring monitor) är en 170 aminosyror E. coli protein som reglerar uttrycket av nedströms SecA (sekretion körning) ATPas i secM-seca operon 6. Nakatogawa och Ito funnit ursprungligen som en 17 aminosyror lång sekvens (150-FSTPVWISQA QGIRA G P-166) i den C-terminala regionen av SecM proteinet kunna räcka för attorsaka blockering av SecM töjning vid Gly165, varigenom peptidyl-glycyl-tRNA stabilt bunden till den ribosomala P-platsen 7-9. Ännu viktigare, fann man att denna 17 aminosyror långa sekvensen kan vara sammansmält med C-terminalen av praktiskt taget vilken full längd och / eller trunkerade proteinet vilket möjliggör framställning av RNC transporterar begynnande kedjor av förutbestämda storlekar 7. Således, när smält eller sättas in i mål-proteinet, producerar SecM tjuvstopp sekvens gripande av polypeptiden kedjeförlängningen och genererar en stabil RNC både in vivo i E. coli-celler och in vitro i ett cellfritt system. Sackarosgradientcentrifugering vidare användas för att isolera RNC. De isolerade RNC kan användas för att analysera strukturella och funktionella egenskaper hos de samtidigt translationella fällbara intermediärer. Nyligen har denna teknik använts framgångsrikt för att få insikt i strukturen av ett flertal ribosom bundna begynnande kedjor 10,11,. Här beskriver vi isoleringen av bovint gamma-B-kristallin RNC smält till SecM och genereras i en in vitro-translationssystem.

Watch this Scientific Journal Video about Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides at JoVE.com

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Vi beskriver här en teknik som nu används rutinmässigt för att isolera stabilt bunden ribosom framväxande kedjan komplex (RNC). Denna teknik drar fördel av upptäckten att en 17 aminosyror lång SecM &quot;gripande sekvens&quot; kan stoppa översättning töjning i en prokaryot (<em&gt; E. coli</em&gt;)-System, när de sätts in (eller fuserad till C-terminalen) av praktiskt taget vilket protein som helst.

Använda SecM Arrest sekvens som ett verktyg för Isolera ribosom Bundna Polypeptider

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces

Microfabricated Post-Array-Detectors mPADs: an Approach to Isolate Mechanical Forces

Mikrofabricerade Post-Array-detektorer (mPADs): en metod att isolera mekaniska krafter

In this video, we will present our approach to measure cellular traction forces using a microfabricated array of posts.  Traction forces are generated ...

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

Korrelat ljus-och elektronmikroskopi (FÖRHUNGRA) som ett verktyg för att visualisera mikroinjiceras molekyler och deras Eukaryota Sub-cellulära mål


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Electroantennographic Biotest som screeningmetod för flyktiga ämnen värdväxt

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolering av ribosom Bundna framväxande Polypeptider<em&gt; In vitro</em&gt; För att identifiera Translationell Paus webbplatser Längs mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Granskning av proteiner bundna till Nascent DNA i däggdjursceller med användning BrdU-Chip-Slot-Western Teknik

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection (LAM) som ett verktyg för transkriptions Profilering av enskilda celltyper

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Magnetisk-aktiverad Cell sortering strategier för att isolera och rena Synovial vätska-Derived mesenkymala stamceller från en kanin-modell

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

En hög utgångs metod för att isolera cerebral pericyter från mus

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...

Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

Transposon-insättningssekvensering som ett verktyg för att belysa bakteriekoloniseringsfaktorer i en Burkholderia gladioli Symbiont av Lagria villosa Beetles

Inferring the function of genes by manipulating their activity is an essential tool for understanding the genetic underpinnings of most biological ...