Name: affinity purification of influenza virus ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells
Uploaded: 2012-06-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells at JoVE.com

De auteurs willen graag Nada Naffakh en Marie-Anne Rameix-Welti (Institut Pasteur) bedanken voor de rWSN-PB2-Strep virus.

<html> Een schematische stroomdiagram van het protocol is weergegeven in Fig. 1 en een tabel van reagentia wordt hieronder weergegeven. 1. Infectie (16 - 24 uur) <ol><li> Zaad van HeLa-cellen in 5 150 mm plastic kweekschalen cel in Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (DMEM) hoge glucose medium, zodat zij bereikt ongeveer 80% confluentie worden de volgende dag (ongeveer 5 x 10 8 cellen). Het is belangrijk dat de cellen niet tot 100% confluentie. </li><...

<ol>
	<li>Engelhardt, O. G., Smith, M., Fodor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+the+influenza+A+virus+RNA-dependent+RNA+polymerase+with+cellular+RNA+polymerase+II.">Association of the influenza A virus RNA-dependent RNA polymerase with cellular RNA polymerase II.</a> J. Virol. 79, 5812-5812 (2005).</li><li>Garcia-Robles, I., Akarsu, H., Müller, C. W., Ruigrok, R., Baudin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+influenza+virus+proteins+with+nucleosomes.">Interaction of influenza virus proteins with nucleosomes.</a> Virology. 332, 329 (2005).</li><li>Chase, G. P., Rameix-Welti, M. A., Zvirbilene, A., Zvirblis, G., Götz, V., Wolff, T., Naffakh, N., Schwemmle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+ribonucleoprotein+complexes+gain+preferential+access+to+cellular+export+machinery+through+chromatin+targeting.">Influenza virus ribonucleoprotein complexes gain preferential access to cellular export machinery through chromatin targeting.</a> PLoS Pathogens. 7, e1002187 (2011).</li><li>Kimura, H., Tao, Y., Roeder, R. G., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+RNA+polymerase+II+and+its+transcription+factors+in+an+HeLa+cell:+little+soluble+holoenzyme+but+significant+amounts+of+polymerases+attached+to+the+nuclear+substructure.">Quantitation of RNA polymerase II and its transcription factors in an HeLa cell: little soluble holoenzyme but significant amounts of polymerases attached to the nuclear substructure.</a> Mol. Cell. Biol. 19, 5383-5383 (1999).</li><li>Henikoff, S., Henikoff, J. G., Sakai, A., Loeb, G. B., Ahmad, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiling+of+salt+fractions+maps+physical+properties+of+chromatin.">Genome-wide profiling of salt fractions maps physical properties of chromatin.</a> Genome Res. 19, 460 (2009).</li><li>Rodriguez, A., Perez-Gonzalez, A., Nieto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+infection+causes+specific+degradation+of+the+largest+subunit+of+cellular+RNA+polymerase+II.">Influenza virus infection causes specific degradation of the largest subunit of cellular RNA polymerase II.</a> J. Virol. 81, 5315-5315 (2007).</li><li>Ye, Z., Liu, T., Offringa, D. P., McInnis, J., Levandowski, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+influenza+virus+matrix+protein+with+ribonucleoproteins.">Association of influenza virus matrix protein with ribonucleoproteins.</a> J. Virol. 73, 7467-7467 (1999).</li><li>Watanabe, T., Watanabe, S., Kawaoka, T., Y, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+networks+involved+in+the+influenza+virus+life+cycle.">Cellular networks involved in the influenza virus life cycle.</a> Cell Host Microbe. 7, 427 (2010).</li><li>Engelhardt, O. G., Fodor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+association+between+viral+and+cellular+transcription+during+influenza+virus+infection.">Functional association between viral and cellular transcription during influenza virus infection.</a> Rev. Med. Virol. 16, 329-345 (2006).</li><li>Schwartz, L. B., Sklar, V. E., Jaehning, J. A., Weinmann, R., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+partial+characterization+of+the+multiple+forms+of+deoxyribonucleic+acid-dependent+ribonucleic+acid+polymerase+in+the+mouse+myeloma,+MOPC+315.">Isolation and partial characterization of the multiple forms of deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase in the mouse myeloma, MOPC 315.</a> J. Biol. Chem. 249, 5889 (1974).</li><li>Lambert, J. P., Baetz, K., Figeys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+proteins+and+DNA--proteomic+role+in+the+field+of+chromatin+research.">Of proteins and DNA--proteomic role in the field of chromatin research.</a> Mol. Biosyst. 6, 30 (2010).</li><li>Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SUMOylation+of+matrix+protein+M1+modulates+the+assembly+and+morphogenesis+of+influenza+A+virus.">The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus.</a> J. Virol. 85, 6618 (2011).</li><li>Liao, T. L., Wu, C. Y., Su, W. C., Jeng, K. S., Lai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+and+deubiquitination+of+NP+protein+regulates+influenza+A+virus+RNA+replication.">Ubiquitination and deubiquitination of NP protein regulates influenza A virus RNA replication.</a> EMBO J. 29, 3879 (2010).</li></ol>

Terwijl veel studies hebben recent geïdentificeerde individuele eiwitten of cellulaire netwerken die betrokken zijn bij influenza virus infectie 8, de functionele betekenis van de meerderheid van deze interacties blijft onduidelijk. Gezien de absolute afhankelijkheid van chromatine-gebaseerde functies voor influenza virus RNA synthese en de complexe biochemische en biofysische aard van de kern 9, zullen nieuwe technieken nodig zijn om deze functies toe te lichten. De subnucleaire fractionering pre...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> DMEM hoge glucose </td><td> Gibco </td><td> 11965-092 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A9418 </td><td></td></tr><tr><td> Proteaseremmer Mix G </td><td> Serva </td><td> 39101 </td><td></td></tr><tr><td> Benzonase Nuclease </td><td> Novagen </td><td> 71206 </td><td> 25 U / pl </td></tr><tr><td> DNase I, RNAse-vrij </td><td> ThermoScientific </td><td> EN0523 </td><td> 50 U / pl </td></tr><tr><td> Dounce homogenisator </td><td> Wheaton </td><td> 432-1271 </td><td> Gebruik het type &quot;B&quot; stamper </td></tr><tr><td> Strep-Tactin Sepharose </td><td> IBA GmbH </td><td> 2-1201-025 </td><td> 50% suspensie kolomindeling kan ook </td></tr><tr><td> Desthiobiotin </td><td> IBAGmbH </td><td> 2-1000-002 </td><td></td></tr></tbody></table>

affinity purification of influenza virus ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells

Zoals alle negatief-RNA virussen is het genoom van influenza virussen verpakt in de vorm van virale ribonucleoproteïne complexen (vRNP), waarbij de enkelstrengs genoom is ingekapseld door het nucleoproteïne (NP) en verbonden met de trimere polymerase complex bestaande van de PA, PB1, en PB2 subeenheden. In tegenstelling tot de meeste RNA virussen, influenzavirussen uitvoeren viraal RNA synthese in de kernen van geïnfecteerde cellen. Interessant virale mRNA synthese gebruikt cellulaire pre-mRNA als primers, en is voorgesteld dat dit proces plaatsvindt op chromatine 1. Interacties tussen de virale polymerase en de gastheer RNA polymerase II, alsmede tussen NP en gastheer nucleosomen ook gekenmerkt 1,2. Onlangs de productie van recombinante influenzavirussen codeert voor een een-Strep-tag genetisch gefuseerd met de C-terminus van het PB2 subeenheid van het virale polymerase (rWSN-PB2-Strep 3) zijnen beschreven. Deze recombinante virussen kunnen de zuivering van pB2-bevattende complexen, zoals vRNPs van geïnfecteerde cellen. Voor het verkrijgen gezuiverd vRNPs worden celculturen geïnfecteerd en vRNPs zijn affiniteit gezuiverd lysaten uit deze cellen. Echter, de lysis procedures voor date gebaseerd op een stap wasmiddel lysis, die ondanks de aanwezigheid van een algemeen nuclease, vaak extract chromatine gebonden materiaal alleen inefficiënt. Ons voorbereidend werk gesuggereerd dat een groot deel van de nucleaire vRNPs niet werden gewonnen tijdens de traditionele cellysis, en daarom geen affiniteit gezuiverd. Om deze extractie-efficiëntie te verhogen en te scheiden chromatine-gebonden van niet-chromatine-gebonden nucleaire vRNPs, hebben we aangepast een stapsgewijze subcellulaire extractie protocol om influenza virus-geïnfecteerde cellen. Kortom, deze procedure scheidt eerste kernen van de cel en extraheert oplosbare nucleaire eiwitten (hier aangeduid als de &quot;nucleoplasmatische&quot; fractie).De resterende onoplosbare kernmateriaal wordt dan geknipt met Benzonase een aspecifieke DNA / RNA nuclease, gevolgd door twee zoutwinning stappen: eerst met 150 mM NaCl (zogenaamde &quot;ch150&quot;), dan 500 mM NaCl (&quot;ch500&quot;) (Fig. 1 ). Deze zoutwinning stappen werden gekozen op basis van onze waarneming dat 500 mM NaCl was voldoende voor het oplossen van meer dan 85% van de nucleaire vRNPs maar toch kan de binding van gelabeld vRNPs om de affiniteit matrix. Na subcellulaire fractionering van geïnfecteerde cellen, is het mogelijk om affiniteit zuiveren PB2-gelabeld vRNPs van elke fractie en analyse van de eiwit-en RNA componenten met Western Blot en primer extension, respectievelijk. Onlangs hebben we gebruikt deze methode om dat vRNP export complexen vorm te ontdekken tijdens de late punten na de infectie op de chromatine-fractie geëxtraheerd met 500 mM NaCl (ch500) 3.

Watch this Scientific Journal Video about Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells at JoVE.com

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Influenza virussen repliceren hun RNA genoom in samenwerking met gastheer-cel chromatine. Hier we een methode intact viraal ribonucleoproteïne complexen zuiveren van chromatine van geïnfecteerde cellen. Gezuiverd virale complexen kunnen worden geanalyseerd door zowel Western blot en primer extension eiwit en RNA inhoud respectievelijk.

Affiniteit Zuivering van Influenza Virus ribonucleoproteïne Complexen van het chromatine van geïnfecteerde cellen

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Generatie van recombinant griepvirus uit plasmide-DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Zuivering van Pathogeen vacuolen uit<em&gt; Legionella</em&gt;-Geïnfecteerde Fagocyten

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Expressie van Functionele Recombinant Hemagglutinine en neuraminidase Eiwitten uit de roman H7N9 Influenza Virus Met de baculovirusexpressiesysteem

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza Virus Voortplanting in bevruchte kippeneieren

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Co-immunoprecipitatie van de Muis Mx1 eiwit met het influenza A-virus nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Nasale Doekjes voor het influenza A-virus detectie en isolatie van Varkens

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Meten Attachment en internalisering van influenza A-virus in A549 cellen door flowcytometrie

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Zuivering van Intracellulair Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; In macrofaag-cellen

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Fenotypische en functionele analyse van geactiveerde regulatoire T-cellen Geïsoleerd van Chronische Lymfatische choriomeningitis-virus geïnfecteerde muizen

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

Bepaling van Biofilm Initiatie on-virus geïnfecteerde cellen door bacteriën en schimmels

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...