Name: affinity purification of influenza virus ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells
Uploaded: 2012-06-03T14:00:00
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Die Autoren bedanken sich bei Nada Naffakh und Marie-Anne Rameix-Welti (Institut Pasteur) für die rWSN-PB2-Strep Virus danken.

<html> Ein schematisches Flussdiagramm des Protokolls ist in gezeigt. 1 und eine Tabelle von Reagenzien wird unten dargestellt. 1. Infection (16 - 24 h) <ol><li> Samen aus HeLa-Zellen in 5 150 mm Zellkulturschalen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) hohen Glucose-Medium, so dass sie erreichen etwa 80% Konfluenz wurden die folgenden Tag (etwa 5 × 10 8 Zellen). Es ist wichtig, dass die Zellen nicht erreichen 100% Konfluenz. </li><li> Am nächsten Tag, v...

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	<li>Engelhardt, O. G., Smith, M., Fodor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+the+influenza+A+virus+RNA-dependent+RNA+polymerase+with+cellular+RNA+polymerase+II.">Association of the influenza A virus RNA-dependent RNA polymerase with cellular RNA polymerase II.</a> J. Virol. 79, 5812-5812 (2005).</li><li>Garcia-Robles, I., Akarsu, H., Müller, C. W., Ruigrok, R., Baudin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+influenza+virus+proteins+with+nucleosomes.">Interaction of influenza virus proteins with nucleosomes.</a> Virology. 332, 329 (2005).</li><li>Chase, G. P., Rameix-Welti, M. A., Zvirbilene, A., Zvirblis, G., Götz, V., Wolff, T., Naffakh, N., Schwemmle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+ribonucleoprotein+complexes+gain+preferential+access+to+cellular+export+machinery+through+chromatin+targeting.">Influenza virus ribonucleoprotein complexes gain preferential access to cellular export machinery through chromatin targeting.</a> PLoS Pathogens. 7, e1002187 (2011).</li><li>Kimura, H., Tao, Y., Roeder, R. G., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+RNA+polymerase+II+and+its+transcription+factors+in+an+HeLa+cell:+little+soluble+holoenzyme+but+significant+amounts+of+polymerases+attached+to+the+nuclear+substructure.">Quantitation of RNA polymerase II and its transcription factors in an HeLa cell: little soluble holoenzyme but significant amounts of polymerases attached to the nuclear substructure.</a> Mol. Cell. Biol. 19, 5383-5383 (1999).</li><li>Henikoff, S., Henikoff, J. G., Sakai, A., Loeb, G. B., Ahmad, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiling+of+salt+fractions+maps+physical+properties+of+chromatin.">Genome-wide profiling of salt fractions maps physical properties of chromatin.</a> Genome Res. 19, 460 (2009).</li><li>Rodriguez, A., Perez-Gonzalez, A., Nieto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+infection+causes+specific+degradation+of+the+largest+subunit+of+cellular+RNA+polymerase+II.">Influenza virus infection causes specific degradation of the largest subunit of cellular RNA polymerase II.</a> J. Virol. 81, 5315-5315 (2007).</li><li>Ye, Z., Liu, T., Offringa, D. P., McInnis, J., Levandowski, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+influenza+virus+matrix+protein+with+ribonucleoproteins.">Association of influenza virus matrix protein with ribonucleoproteins.</a> J. Virol. 73, 7467-7467 (1999).</li><li>Watanabe, T., Watanabe, S., Kawaoka, T., Y, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+networks+involved+in+the+influenza+virus+life+cycle.">Cellular networks involved in the influenza virus life cycle.</a> Cell Host Microbe. 7, 427 (2010).</li><li>Engelhardt, O. G., Fodor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+association+between+viral+and+cellular+transcription+during+influenza+virus+infection.">Functional association between viral and cellular transcription during influenza virus infection.</a> Rev. Med. Virol. 16, 329-345 (2006).</li><li>Schwartz, L. B., Sklar, V. E., Jaehning, J. A., Weinmann, R., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+partial+characterization+of+the+multiple+forms+of+deoxyribonucleic+acid-dependent+ribonucleic+acid+polymerase+in+the+mouse+myeloma,+MOPC+315.">Isolation and partial characterization of the multiple forms of deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase in the mouse myeloma, MOPC 315.</a> J. Biol. Chem. 249, 5889 (1974).</li><li>Lambert, J. P., Baetz, K., Figeys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+proteins+and+DNA--proteomic+role+in+the+field+of+chromatin+research.">Of proteins and DNA--proteomic role in the field of chromatin research.</a> Mol. Biosyst. 6, 30 (2010).</li><li>Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SUMOylation+of+matrix+protein+M1+modulates+the+assembly+and+morphogenesis+of+influenza+A+virus.">The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus.</a> J. Virol. 85, 6618 (2011).</li><li>Liao, T. L., Wu, C. Y., Su, W. C., Jeng, K. S., Lai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+and+deubiquitination+of+NP+protein+regulates+influenza+A+virus+RNA+replication.">Ubiquitination and deubiquitination of NP protein regulates influenza A virus RNA replication.</a> EMBO J. 29, 3879 (2010).</li></ol>

Während viele Studien, die kürzlich einzelne Proteine ​​oder Mobilfunknetze in Influenzavirus-Infektion beteiligt sind 8 identifiziert haben, bleibt die funktionelle Bedeutung der meisten dieser Interaktionen unklar. Angesichts der absoluten Abhängigkeit von Chromatin-basierten Funktionen für Influenza-Virus RNA-Synthese und die komplexe biophysikalische und biochemische Natur des Kerns 9, werden neue Techniken erforderlich, um diese Funktionen aufzuklären. Die Fraktionierung subnuklearen ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> DMEM-Hochglycose </td><td> Gibco </td><td> 11965-092 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A9418 </td><td></td></tr><tr><td> Protease-Inhibitor Mix G </td><td> Serva </td><td> 39101 </td><td></td></tr><tr><td> Benzonase Nuclease </td><td> Novagen </td><td> 71206 </td><td> 25 U / ul </td></tr><tr><td> DNase I, RNase-frei </td><td> ThermoScientific </td><td> EN0523 </td><td> 50 U / ul </td></tr><tr><td> Dounce Homogenisator </td><td> Wheaton </td><td> 432-1271 </td><td> Benutze Typ &quot;B&quot; Pistill </td></tr><tr><td> Strep-Tactin Sepharose </td><td> IBA GmbH </td><td> 2-1201-025 </td><td> 50% igen Suspension Spalte kann auch dazu verwendet werden </td></tr><tr><td> Desthiobiotin </td><td> IBAGmbH </td><td> 2-1000-002 </td><td></td></tr></tbody></table>

affinity purification of influenza virus ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells

Wie alle Negativ-Strang-RNA-Viren, wird das Genom von Influenzaviren in Form von viralen Ribonukleoproteinkomplexe (vRNP), in dem die einzelsträngige Genoms durch das Nukleoprotein (NP) eingekapselt ist, und mit der Polymerase-Komplex aus trimeren verpackt der PA, PB1, PB2 und Untereinheiten. Allerdings, im Gegensatz zu den meisten RNA-Viren, Influenza-Viren führen virale RNA-Synthese in den Kernen der infizierten Zellen. Interessanterweise verwendet virale mRNA-Synthese zelluläre prä-mRNAs als Primer, und es wurde vorgeschlagen, dass dieser Prozess stattfindet Chromatin 1. Wechselwirkungen zwischen dem viralen Polymerase und der Wirts-RNA-Polymerase II, sowie zwischen NP und Host Nukleosomen wurden auch 1,2 ist. Vor kurzem hat die Erzeugung von rekombinanten Influenza Viren, die für eine Ein-Strep-Tag genetisch mit dem C-Terminus des PB2-Untereinheit der viralen Polymerase (rWSN-PB2-Strep 3) fusioniert hat seinen beschrieben. Diese rekombinanten Viren können die Reinigung von PB2-enthaltende Komplexe, einschließlich vRNPs, aus infizierten Zellen. Zur Gewinnung gereinigter vRNPs werden Zellkulturen infiziert und vRNPs sind affinitätsgereinigt aus Lysaten aus diesen Zellen abgeleitet. Allerdings haben die Lyse bisher angewandten auf einer Schritt-Detergens-Lyse, die, trotz der Gegenwart eines allgemeinen Nuklease, oft zu extrahieren Chromatin-gebundene Material nur ineffizient gestützt. Unsere Vorarbeiten schlug vor, dass ein großer Teil der nuklearen nicht vRNPs wurden während der traditionellen Zell-Lyse extrahiert, und konnte deshalb nicht Affinität gereinigt werden. Um diese Extraktion Effizienz zu steigern, und zur Trennung von nicht-nuklearen Chromatin-gebundenen vRNPs Chromatin-gebunden, passten wir einen stufenweisen Extraktion subzelluläre Protokoll, um Influenza-Virus-infizierten Zellen. Kurz gesagt, dieses Verfahren zuerst trennt die Kerne aus der Zelle und extrahiert dann lösliche nukleäre Proteine ​​(hier als die &quot;nukleoplasmatischen&quot;-Fraktion).Das verbleibende unlösliche nukleare Material wird dann mit Benzonase, ein unspezifischer DNA / RNA-Nuclease, die von zwei Salzgewinnung Schritte befolgt verdaut: zuerst mit 150 mM NaCl (genannt &quot;CH150&quot;), dann 500 mM NaCl (&quot;CH500&quot;) (Abb. 1 ). Diese Salzgewinnung Schritte wurden auf der Grundlage unserer Beobachtung gewählt, dass 500 mM NaCl ausreichend, um über 85% der nuklearen vRNPs solubilisieren dennoch erlauben die Bindung von getaggt vRNPs an die Affinitätsmatrix war. Nach subzelluläre Fraktionierung der infizierten Zellen, ist es möglich, Affinitätsreinigung PB2-markierten vRNPs von jedem einzelnen Fraktion und Analyse der Protein und RNA-Komponenten unter Verwendung von Western-Blot und Primer-Extension, jeweils. Vor kurzem verwendeten wir diese Methode, um diese vRNP Export Komplexe Form während des späten Punkte nach der Infektion auf der Chromatin-Fraktion mit 500 mM NaCl (CH500) 3 extrahiert entdecken.

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Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Influenza-Viren replizieren ihre RNA-Genom in Verbindung mit Host-Zell-Chromatin. Hier präsentieren wir eine Methode, um intakte virale Ribonukleoproteinkomplexe aus dem Chromatin von infizierten Zellen zu reinigen. Gereinigten viralen Komplexe können sowohl durch Western-Blot und Primer-Extension von Protein-und RNA-Gehalt analysiert werden, beziehungsweise.

Affinitätsreinigung des Influenza-Virus Ribonukleoproteinkomplexe aus dem Chromatin der infizierten Zellen

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Erzeugung von rekombinanten Influenza Virus von Plasmid-DNA

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Forschung

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Die Reinigung von Pathogen Vakuolen aus<em&gt; Legionellen</em&gt;-Infizierten Phagozyten

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

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Rekombinante Expression von Funktions Hämagglutinin und Neuraminidase-Proteine ​​aus dem Roman H7N9 Influenza-Virus mit dem Baculovirus-Expressionssystem

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

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Nasal Tücher für Influenza-A-Virus-Erkennung und Isolierung von Schweine

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