Name: affinity purification of influenza virus ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells
Uploaded: 2012-06-03T14:00:00
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著者らは、rWSN-PB2-球菌ウイルスの灘Naffakhとマリー·アンRameix-Welti（パスツール研究所）に感謝したいと思います。

<html>プロトコルの概略フローチャートを図に示されています。 1と試薬のテーブルは以下に提示されています。 1。感染症（16から24時間） <ol><li>ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）高さは次の日（約5×10 8細胞）の約80％コンフルエントに達するようなグルコース培地、5 150ミリメートルのプラスチック細胞培養ディッシュにHeLa細胞外シ...

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	<li>Engelhardt, O. G., Smith, M., Fodor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+the+influenza+A+virus+RNA-dependent+RNA+polymerase+with+cellular+RNA+polymerase+II.">Association of the influenza A virus RNA-dependent RNA polymerase with cellular RNA polymerase II.</a> J. Virol. 79, 5812-5812 (2005).</li><li>Garcia-Robles, I., Akarsu, H., Müller, C. W., Ruigrok, R., Baudin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+influenza+virus+proteins+with+nucleosomes.">Interaction of influenza virus proteins with nucleosomes.</a> Virology. 332, 329 (2005).</li><li>Chase, G. P., Rameix-Welti, M. A., Zvirbilene, A., Zvirblis, G., Götz, V., Wolff, T., Naffakh, N., Schwemmle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+ribonucleoprotein+complexes+gain+preferential+access+to+cellular+export+machinery+through+chromatin+targeting.">Influenza virus ribonucleoprotein complexes gain preferential access to cellular export machinery through chromatin targeting.</a> PLoS Pathogens. 7, e1002187 (2011).</li><li>Kimura, H., Tao, Y., Roeder, R. G., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+RNA+polymerase+II+and+its+transcription+factors+in+an+HeLa+cell:+little+soluble+holoenzyme+but+significant+amounts+of+polymerases+attached+to+the+nuclear+substructure.">Quantitation of RNA polymerase II and its transcription factors in an HeLa cell: little soluble holoenzyme but significant amounts of polymerases attached to the nuclear substructure.</a> Mol. Cell. Biol. 19, 5383-5383 (1999).</li><li>Henikoff, S., Henikoff, J. G., Sakai, A., Loeb, G. B., Ahmad, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiling+of+salt+fractions+maps+physical+properties+of+chromatin.">Genome-wide profiling of salt fractions maps physical properties of chromatin.</a> Genome Res. 19, 460 (2009).</li><li>Rodriguez, A., Perez-Gonzalez, A., Nieto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+infection+causes+specific+degradation+of+the+largest+subunit+of+cellular+RNA+polymerase+II.">Influenza virus infection causes specific degradation of the largest subunit of cellular RNA polymerase II.</a> J. Virol. 81, 5315-5315 (2007).</li><li>Ye, Z., Liu, T., Offringa, D. P., McInnis, J., Levandowski, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+influenza+virus+matrix+protein+with+ribonucleoproteins.">Association of influenza virus matrix protein with ribonucleoproteins.</a> J. Virol. 73, 7467-7467 (1999).</li><li>Watanabe, T., Watanabe, S., Kawaoka, T., Y, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+networks+involved+in+the+influenza+virus+life+cycle.">Cellular networks involved in the influenza virus life cycle.</a> Cell Host Microbe. 7, 427 (2010).</li><li>Engelhardt, O. G., Fodor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+association+between+viral+and+cellular+transcription+during+influenza+virus+infection.">Functional association between viral and cellular transcription during influenza virus infection.</a> Rev. Med. Virol. 16, 329-345 (2006).</li><li>Schwartz, L. B., Sklar, V. E., Jaehning, J. A., Weinmann, R., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+partial+characterization+of+the+multiple+forms+of+deoxyribonucleic+acid-dependent+ribonucleic+acid+polymerase+in+the+mouse+myeloma,+MOPC+315.">Isolation and partial characterization of the multiple forms of deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase in the mouse myeloma, MOPC 315.</a> J. Biol. Chem. 249, 5889 (1974).</li><li>Lambert, J. P., Baetz, K., Figeys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+proteins+and+DNA--proteomic+role+in+the+field+of+chromatin+research.">Of proteins and DNA--proteomic role in the field of chromatin research.</a> Mol. Biosyst. 6, 30 (2010).</li><li>Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SUMOylation+of+matrix+protein+M1+modulates+the+assembly+and+morphogenesis+of+influenza+A+virus.">The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus.</a> J. Virol. 85, 6618 (2011).</li><li>Liao, T. L., Wu, C. Y., Su, W. C., Jeng, K. S., Lai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+and+deubiquitination+of+NP+protein+regulates+influenza+A+virus+RNA+replication.">Ubiquitination and deubiquitination of NP protein regulates influenza A virus RNA replication.</a> EMBO J. 29, 3879 (2010).</li></ol>

多くの研究が最近、個々のタンパク質やインフルエンザウイルス感染8に関与する細胞のネットワークを識別しているが、これらの相互作用の大部分の機能的意義は不明である。インフルエンザウイルスRNA合成と核9の複雑な生物物理学的および生化学的性質のためにクロマチンベースの関数の絶対的な依存性を考えると、新技術は、これらの機能を解明する必要があります。 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> DMEM高グルコース</td><td>ギブコ</td><td> 11965-092 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td>シグマ</td><td> A9418 </td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤ミックスG </td><td> Serva </td><td> 39101 </td><td></td></tr><tr><td>ベンゾナーゼヌクレアーゼ</td><td> Novagen社</td><td> 71206 </td><td> 25 U /μlの</td></tr><tr><td>のDNase I、RNaseフリー</td><td> ThermoScientific </td><td> EN0523 </td><td> 50 U /μlの</td></tr><tr><td>ダウンスホモジナイザー</td><td>ホイートン</td><td> 432-1271 </td><td> &quot;B&quot;乳棒を入力して使用</td></tr><tr><td>のStrep-Tactinセファロース</td><td> IBA GmbH社</td><td> 2-1201-025 </td><td> 50％懸濁液カラムフォーマットを使用することもできます</td></tr><tr><td> Desthiobiotin </td><td> IBA社</td><td> 2-1000-002 </td><td></td></tr></tbody></table>

affinity purification of influenza virus ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells

すべてのマイナス鎖RNAウイルスと同様に、インフルエンザウイルスのゲノムは一本鎖ゲノムは核タンパク質（NP）で包まれ、構成される三量体ポリメラーゼ複合体と関連付けされているウイルスのリボ核タンパク質複合体（vRNPを）の形でパッケージ化されていますPA、PB1、PB2サブユニットとの。しかし、ほとんどのRNAウイルスとは対照的に、インフルエンザウイルスは、感染細胞の核内にウイルスのRNA合成を実行します。興味深いことに、ウイルスmRNAの合成は、プライマーとして、携帯プレmRNAを使用しており、それは、このプロセスは、クロマチン1日に行われることが提案されている。ウイルスポリメラーゼ及び宿主RNAポリメラーゼIIと同様に、NPとホストヌクレオソーム間の相互作用はまた、1,2特徴づけられている。 最近では、One-Strepタグをコードする組換えインフルエンザウイルスの発生は遺伝的であるウイルスポリメラーゼのPB2サブユニットのC末端（rWSN-PB2-球菌3）にした融合enは説明します。これらの組換えウイルスは、感染細胞からのvRNPsなど、PB2を含む複合体の精製を可能にします。精製されたvRNPsを取得するために、培養細胞が感染されており、vRNPsは、親和性、これらの細胞から派生したライセートから精製されています。ただし、日付に使用される溶解の手順は、一般的なヌクレアーゼの存在にもかかわらず、しばしば唯一の非効率的にクロマチンに結合した物質を抽出し、ワンステップの洗剤溶解に基づいてされています。 私たちの予備的な作業は、核vRNPsの大部分は伝統的な細胞溶解中に抽出されなかったことを示唆し、したがって、アフィニティー精製することができませんでした。この抽出効率を高めるために、非クロマチン結合型核vRNPsからクロマチンに結合分離するために、我々は、インフルエンザウイルス感染細胞へ段階的に細胞内抽出プロトコルを適応した。簡単に言うと、このプロシージャは、最初のセルから核を分離し、（ここでは &quot;nucleoplasmic&quot;分数と呼ばれる）水溶性核タンパク質を抽出します。残りの不溶性の核物質は、その後ベンゾナーゼ、二つの塩の抽出手順に続いて非特異的なDNA / RNAヌクレアーゼで消化されます：最初の150mM NaClを（ &quot;ch150&quot;と呼ばれる）を使用し、500mMのNaCl（ &quot;ch500&quot;）（ 図1 。）これらの塩抽出の手順はまだ親和性マトリックスへのタグ付けvRNPsの結合を許可500mMのNaCl、まだ核vRNPsの85％以上を可溶化するのに十分であったという我々の観察に基づいて選ばれました。 感染細胞の細胞内分画後、それは、それぞれ個々の画分からPB2-タグvRNPsの親和性を精製し、それらの蛋白質およびウエスタンブロットおよびプライマー伸長を用いてRNA成分を分析することが可能である。最近、我々は3 500mMのNaCl（ch500）で抽出したクロマチン画分で感染した後に遅れてのポイントの間にそのvRNPをエクスポートする複合体の形を発見するためにこのメソッドを使用しました。

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Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

インフルエンザウイルスは、宿主細胞のクロマチンに関連して、そのRNAゲノムを複製します。ここでは、感染細胞のクロマチンから無傷のウイルスのリボ核タンパク質複合体を精製する手法を提案する。ウイルスの複合体を精製し、それぞれウェスタンブロット、タンパク質およびRNA含量のプライマー伸長の両方で解析することができます。

感染細胞のクロマチンからのインフルエンザウイルスのリボ核タンパク質複合体のアフィニティ精製

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

プラスミドDNAの組換えインフルエンザウイルスの生成

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

病原体胞の精製から<em&gt;レジオネラ菌</em&gt;感染した食細胞

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

バキュロウイルス発現系を用いた新規H7N9インフルエンザウイルス由来の機能組換えヘマグルチニンとノイラミニダーゼタンパク質の発現

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

鶏卵卵におけるインフルエンザウイルスの伝播

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

インフルエンザAウイルス核を持つマウスMx1のタンパク質の共免疫沈降

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

豚からのインフルエンザAウイルスの検出および単離のための鼻ワイプ

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

フローサイトメトリーによって、A549細胞におけるインフルエンザAウイルスの添付ファイルと内在化を測定

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA精製は、細胞内から成長します<em&gt;リステリア菌</em&gt;マクロファージ細胞で

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

表現型および慢性リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスに感染したマウスから単離された活性化制御性T細胞の機能解析

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

細菌や真菌によってウイルス感染細胞上のバイオフィルムの開始の決意

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...