Name: affinity purification of influenza virus ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells
Uploaded: 2012-06-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells at JoVE.com

Yazarlar RWSN PB2-Strep virüs için Nada Naffakh ve Marie-Anne Rameix-Welti (Institut Pasteur) teşekkür etmek istiyorum.

<html> Protokolünün şematik akış şeması Şek. 1 ve reaktifleri bir tablo aşağıda sunulmuştur. 1. Enfeksiyon (16 - 24 saat) <ol><li> Dulbecco&#39;nun değiştirilmiş Eagle ortamı (DMEM)-yüksek bunlar ertesi gün (yaklaşık 5 x 10 hücre 8) yaklaşık% 80 konfluent ulaşacak örneğin glikoz, orta, 5 mm 150 plastik hücre kültür tabaklarında HeLa hücreleri tohumu. Bu hücreler% 100 birbirine karışmış ulaşamamaktadır olması önemlidir. </li...

<ol>
	<li>Engelhardt, O. G., Smith, M., Fodor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+the+influenza+A+virus+RNA-dependent+RNA+polymerase+with+cellular+RNA+polymerase+II.">Association of the influenza A virus RNA-dependent RNA polymerase with cellular RNA polymerase II.</a> J. Virol. 79, 5812-5812 (2005).</li><li>Garcia-Robles, I., Akarsu, H., Müller, C. W., Ruigrok, R., Baudin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+influenza+virus+proteins+with+nucleosomes.">Interaction of influenza virus proteins with nucleosomes.</a> Virology. 332, 329 (2005).</li><li>Chase, G. P., Rameix-Welti, M. A., Zvirbilene, A., Zvirblis, G., Götz, V., Wolff, T., Naffakh, N., Schwemmle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+ribonucleoprotein+complexes+gain+preferential+access+to+cellular+export+machinery+through+chromatin+targeting.">Influenza virus ribonucleoprotein complexes gain preferential access to cellular export machinery through chromatin targeting.</a> PLoS Pathogens. 7, e1002187 (2011).</li><li>Kimura, H., Tao, Y., Roeder, R. G., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+RNA+polymerase+II+and+its+transcription+factors+in+an+HeLa+cell:+little+soluble+holoenzyme+but+significant+amounts+of+polymerases+attached+to+the+nuclear+substructure.">Quantitation of RNA polymerase II and its transcription factors in an HeLa cell: little soluble holoenzyme but significant amounts of polymerases attached to the nuclear substructure.</a> Mol. Cell. Biol. 19, 5383-5383 (1999).</li><li>Henikoff, S., Henikoff, J. G., Sakai, A., Loeb, G. B., Ahmad, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiling+of+salt+fractions+maps+physical+properties+of+chromatin.">Genome-wide profiling of salt fractions maps physical properties of chromatin.</a> Genome Res. 19, 460 (2009).</li><li>Rodriguez, A., Perez-Gonzalez, A., Nieto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+infection+causes+specific+degradation+of+the+largest+subunit+of+cellular+RNA+polymerase+II.">Influenza virus infection causes specific degradation of the largest subunit of cellular RNA polymerase II.</a> J. Virol. 81, 5315-5315 (2007).</li><li>Ye, Z., Liu, T., Offringa, D. P., McInnis, J., Levandowski, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+influenza+virus+matrix+protein+with+ribonucleoproteins.">Association of influenza virus matrix protein with ribonucleoproteins.</a> J. Virol. 73, 7467-7467 (1999).</li><li>Watanabe, T., Watanabe, S., Kawaoka, T., Y, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+networks+involved+in+the+influenza+virus+life+cycle.">Cellular networks involved in the influenza virus life cycle.</a> Cell Host Microbe. 7, 427 (2010).</li><li>Engelhardt, O. G., Fodor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+association+between+viral+and+cellular+transcription+during+influenza+virus+infection.">Functional association between viral and cellular transcription during influenza virus infection.</a> Rev. Med. Virol. 16, 329-345 (2006).</li><li>Schwartz, L. B., Sklar, V. E., Jaehning, J. A., Weinmann, R., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+partial+characterization+of+the+multiple+forms+of+deoxyribonucleic+acid-dependent+ribonucleic+acid+polymerase+in+the+mouse+myeloma,+MOPC+315.">Isolation and partial characterization of the multiple forms of deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase in the mouse myeloma, MOPC 315.</a> J. Biol. Chem. 249, 5889 (1974).</li><li>Lambert, J. P., Baetz, K., Figeys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+proteins+and+DNA--proteomic+role+in+the+field+of+chromatin+research.">Of proteins and DNA--proteomic role in the field of chromatin research.</a> Mol. Biosyst. 6, 30 (2010).</li><li>Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SUMOylation+of+matrix+protein+M1+modulates+the+assembly+and+morphogenesis+of+influenza+A+virus.">The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus.</a> J. Virol. 85, 6618 (2011).</li><li>Liao, T. L., Wu, C. Y., Su, W. C., Jeng, K. S., Lai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+and+deubiquitination+of+NP+protein+regulates+influenza+A+virus+RNA+replication.">Ubiquitination and deubiquitination of NP protein regulates influenza A virus RNA replication.</a> EMBO J. 29, 3879 (2010).</li></ol>

Birçok çalışmada son zamanlarda bireysel protein ya da grip virüsü enfeksiyonu 8 katılan hücresel ağları tespit ederken, bu etkileşimlerin çoğunluğunun fonksiyonel önemi belirsizdir. Grip virüsü RNA sentezi ve çekirdeğinde 9 karmaşık biofiziksel ve biyokimyasal doğaya kromatin bazlı fonksiyonların mutlak bağımlılığı göz önüne alındığında, yeni teknikler bu fonksiyonları aydınlatmak için gerekli olacaktır. VRNPs bir afinite saflaştırma ile birleştiğinde b...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> DMEM-yüksek glukoz </td><td> Gibco </td><td> 11965-092 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A9418 </td><td></td></tr><tr><td> Proteaz inhibitörü Mix G </td><td> Serva </td><td> 39101 </td><td></td></tr><tr><td> Benzonase Nükleaz </td><td> Novagen </td><td> 71206 </td><td> 25 U / ml </td></tr><tr><td> DNaz I, RNaz-free </td><td> ThermoScientific </td><td> EN0523 </td><td> 50 U / ml </td></tr><tr><td> Homojenizatör Dounce </td><td> Wheaton </td><td> 432-1271 </td><td> &quot;B&quot; havaneli yazın kullanın </td></tr><tr><td> Strep-Tactin Sepharose </td><td> IBA GmbH </td><td> 2-1201-025 </td><td> % 50 süspansiyon sütun biçiminde de kullanılabilir </td></tr><tr><td> Desthiobiotin </td><td> IBAGmbH </td><td> 2-1000-002 </td><td></td></tr></tbody></table>

affinity purification of influenza virus ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells

Tüm negatif dallı RNA virüsleri gibi, influenza virüs genomu tek zincirli genom nükleoprotein (NP) tarafından kapsül içine, ve oluşan trimeric polimeraz kompleksi ile ilişkili olduğu viral ribonükleoprotein kompleksleri (vRNP), formunda paketlenmiş PA, PB1 ve PB2 alt birimlerinin. Bununla birlikte, çoğu RNA virüslerinin aksine, influenza virüs enfekte olmuş hücreler, çekirdeklerinde viral RNA&#39;nın sentezi gerçekleştirmek. İlginçtir, viral mRNA sentezi primer olarak hücresel öncesi mRNA&#39;ların kullanır ve bu süreç kromatin 1 gerçekleşir ileri sürülmektedir. Viral polimeraz ve konak RNA polimeraz II yanı sıra, NP ve ev sahibi arasındaki nükleozom arasındaki etkileşimlerin da 1,2 karakterize edilmiştir. Yakın zamanda, bir tek Strep-Tag kodlayan rekombinant influenza virüsünün üretimi genetik olarak viral polimeraz PB2 alt biriminin C-terminali (RWSN-PB2-Strep 3) kadar olan kaynaşmıştr nitelendirdi. Bu rekombinant virüsler enfekte olmuş hücreler arası vRNPs dahil olmak üzere PB2-içeren kompleksleri, bir saflaştırma izin verir. VRNPs saflaştırılmış elde etmek için, enfekte hücre kültürleri ve vRNPs bu hücreler elde lizatları arındırılan afinitesi vardır edilir. Ancak, bugüne kadar kullanılan parçalama işlemleri genel bir nükleaz varlığına rağmen, çoğu zaman sadece verimsiz kromatin bağlı materyali çıkarmak, bir adım deterjan lizis dayalı olarak yapılmıştır. Bizim ön çalışma nükleer vRNPs büyük bir kısmı geleneksel bir hücre parçalanması sırasında elde olmadığını düşündürmüştür ve bu nedenle afinite saflaştırılmış olamazdı. Bu ekstraksiyon verimini artırmak için, ve non-kromatin bağlı nükleer vRNPs gelen kromatin-bağlı ayırmak için, biz grip virüsü ile enfekte olmuş hücrelerde bir adım bilge Subselüler çıkarma protokolü uyarlanmıştır. Kısaca, bu prosedür ilk hücreden çekirdek ayırır ve daha sonra eriyen nükleer proteinler (burada &quot;nucleoplasmic&quot; fraksiyon olarak adlandırılır) ayıklar.Kalan çözünmeyen nükleer malzeme ardından Benzonase, iki tuz çıkarımı adımları takip belirsiz bir DNA / RNA nükleaz ile sindirilir: İlk 150 mM NaCl (&quot;ch150&quot; olarak adlandırılır) kullanılarak, daha sonra 500 mM NaCl (&quot;ch500&quot;) (Şekil 1 ). Bu tuz ekstraksiyon adımları 500 mM NaCl henüz hala yakınlık matrisi tagged vRNPs bağlayıcı izin nükleer vRNPs% 85&#39;inden çözünürleştirmek için yeterli olduğu konusunda bizim gözlemlerimize göre seçilmiştir. Enfekte olmuş hücrelerin hücre içi fraksiyonasyon sonra, her bir fraksiyondan afinite purify PB2-etiketli vRNPs mümkündür ve protein ve sırasıyla, Western blot ve astar uzantısı, RNA kullanılarak analiz bileşenler. Son zamanlarda, 500 mM NaCl (ch500) 3 ile ekstrakte kromatin fraksiyonu üzerine enfeksiyon sonrası geç noktaları sırasında bu vRNP ihracat kompleksleri şeklinde keşfetmek için bu yöntem kullanılmıştır.

Watch this Scientific Journal Video about Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells at JoVE.com

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Grip virüsleri konak hücre kromatin ile birlikte kendi RNA genomu çoğaltmak. Burada, enfekte olmuş hücrelerin kromatin gelen sağlam virüs ribonükleoprotein kompleksleri arındırmak için bir yöntem sunulmaktadır. Viral kompleksleri Arıtılmış sırasıyla, Western blot ve protein ve RNA içerikleri astar uzantısı hem de analiz edilebilir.

Enfekte Hücre Kromatin gelen Gribi ribonükleoprotein Komplekslerinin Affinity Arıtma

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Plazmid DNA Rekombinant Grip Virüsü Üretimi

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Patojen Vakuoller saflaştırılması gelen<em&gt; Legionella</em&gt;-Enfekte Fagositler

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Bakülovirüs İfade Sistemi ile Novel H7N9 influenza virüs hemaglutinin Fonksiyonel rekombinant ve Neuraminidase Proteinlerin İfadesi

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Embriyone Tavuk Yumurta Grip Virüsü Yayılım

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

İnfluenza A virüsü nükleoproteini Fare MX1 Protein Co-immunopresipitasyonu

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Domuz influenza A virüs Algılama ve İzolasyonu için Burun Mendil

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Akış Sitometrisi ile A549 Hücreleri Eklenti ve içselleştirilmesi Gribi bir virüs Ölçme

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Arıtma Hücre içindeki dan Yetiştirilen<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Makrofaj

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Fenotipik ve Kronik Lenfositik koryomenenjit Virüs ile enfekte Fare İzole Aktif Düzenleyici T hücrelerinin Fonksiyonel Analiz

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

Bakteri ve mantar virüsle enfekte olmuş hücreler üzerinde Biyofilm Başlatma Belirlenmesi

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...