Name: two methods of heterokaryon formation to discover hcv restriction factors
Uploaded: 2012-07-16T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors at JoVE.com

אנו מודים Takaji Wakita ו Jens בוך עבור JFH1 ומבודד J6CF, בהתאמה. כמו כן אנו מודים צ&#39;ארלס רייס על הא-7.5 התאים נוגדנים 9E10, סטיבן Foung עבור E2 נוגדנים ספציפיים CBH-23, וכל חברי המחלקה לוירולוגיה ניסיוני, Twincore לקבלת הצעות ודיונים מועילות.

תא Fusion ידי PEG 1. תא תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות הא, 7.5, הלה Hep56.1D שורות תאים נאיביים או אריזה 12 על 15 ס&quot;מ תא הכלים תרבות ב DMEM מלאה (DMEM cplt) בינוני, בתוספת DMEM עם 2 מ&quot;מ L-גלוטמין, 1X לא חיוניות חומצות אמ...

<ol>
	<li>Zhu, Q., Guo, J. T., Seeger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+hepatitis+C+virus+subgenomes+in+nonhepatic+epithelial+and+mouse+hepatoma+cells.">Replication of hepatitis C virus subgenomes in nonhepatic epithelial and mouse hepatoma cells.</a> J. Virol. 77, 9204-9210 (2003).</li><li>Kato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonhepatic+cell+lines+HeLa+and+293+support+efficient+replication+of+the+hepatitis+C+virus+genotype+2a+subgenomic+replicon.">Nonhepatic cell lines HeLa and 293 support efficient replication of the hepatitis C virus genotype 2a subgenomic replicon.</a> J. Virol. 79, 592-596 (2005).</li><li>Ali, S., Pellerin, C., Lamarre, D., Kukolj, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+subgenomic+replicons+in+the+human+embryonic+kidney+293+cell+line.">Hepatitis C virus subgenomic replicons in the human embryonic kidney 293 cell line.</a> J. Virol. 78, 491-501 (2004).</li><li>Date, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype+2a+hepatitis+C+virus+subgenomic+replicon+can+replicate+in+HepG2+and+IMY-N9+cells.">Genotype 2a hepatitis C virus subgenomic replicon can replicate in HepG2 and IMY-N9 cells.</a> J. Biol. Chem. 279, 22371-22376 (2004).</li><li>Chang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+hepatitis+C+virus+(HCV)+RNA+in+mouse+embryonic+fibroblasts:+protein+kinase+R+(PKR)-dependent+and+PKR-independent+mechanisms+for+controlling+HCV+RNA+replication+and+mediating+interferon+activities.">Replication of hepatitis C virus (HCV) RNA in mouse embryonic fibroblasts: protein kinase R (PKR)-dependent and PKR-independent mechanisms for controlling HCV RNA replication and mediating interferon activities.</a> J. Virol. 80, 7364-7374 (2006).</li><li>Zhong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+hepatitis+C+virus+infection+in+vitro.">Robust hepatitis C virus infection in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 9294-9299 (2005).</li><li>Lindenbach, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+replication+of+hepatitis+C+virus+in+cell+culture.">Complete replication of hepatitis C virus in cell culture.</a> Science. 309, 623-626 (2005).</li><li>Wakita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+infectious+hepatitis+C+virus+in+tissue+culture+from+a+cloned+viral+genome.">Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome.</a> Nat. Med. 11, 791-796 (2005).</li><li>Witteveldt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD81+is+dispensable+for+hepatitis+C+virus+cell-to-cell+transmission+in+hepatoma+cells.">CD81 is dispensable for hepatitis C virus cell-to-cell transmission in hepatoma cells.</a> J. Gen. Virol. 90, 48-58 (2009).</li><li>Bitzegeio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+hepatitis+C+virus+to+mouse+CD81+permits+infection+of+mouse+cells+in+the+absence+of+human+entry+factors.">Adaptation of hepatitis C virus to mouse CD81 permits infection of mouse cells in the absence of human entry factors.</a> PLoS Pathog. 6, e1000978 (2010).</li><li>Lindemann, D., Goepfert, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+foamy+virus+envelope+glycoproteins.">The foamy virus envelope glycoproteins.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 277, 111-129 (2003).</li><li>Brohm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+determinants+important+for+hepatitis+C+virus+p7+function+in+morphogenesis+by+using+trans-complementation.">Characterization of determinants important for hepatitis C virus p7 function in morphogenesis by using trans-complementation.</a> J. Virol. 83, 11682-11693 (2009).</li><li>Steinmann, E., Brohm, C., Kallis, S., Bartenschlager, R., Pietschmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+trans-encapsidation+of+hepatitis+C+virus+RNAs+into+infectious+virus-like+particles.">Efficient trans-encapsidation of hepatitis C virus RNAs into infectious virus-like particles.</a> J. Virol. 82, 7034-7046 (2008).</li><li>Koutsoudakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+early+steps+of+hepatitis+C+virus+infection+by+using+luciferase+reporter+viruses.">Characterization of the early steps of hepatitis C virus infection by using luciferase reporter viruses.</a> J. Virol. 80, 5308-5320 (2006).</li><li>Frentzen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Completion+of+hepatitis+C+virus+replication+cycle+in+heterokaryons+excludes+dominant+restrictions+in+human+non-liver+and+mouse+liver+cell+lines.">Completion of hepatitis C virus replication cycle in heterokaryons excludes dominant restrictions in human non-liver and mouse liver cell lines.</a> PLoS Pathog. 7, e1002029 (2011).</li><li>Lindemann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+particle-associated+glycoprotein+signal+peptide+essential+for+virus+maturation+and+infectivity.">A particle-associated glycoprotein signal peptide essential for virus maturation and infectivity.</a> J. Virol. 75, 5762-5771 (2001).</li><li>Blight, K. J., McKeating, J. A., Rice, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+permissive+cell+lines+for+subgenomic+and+genomic+hepatitis+C+virus+RNA+replication.">Highly permissive cell lines for subgenomic and genomic hepatitis C virus RNA replication.</a> J. Virol. 76, 13001-13014 (2002).</li></ol>

אנו מציגים שתי שיטות להשרות היווצרות heterokaryon בתאים בתרבית ניתוח של מגבלות שליליים דומיננטיים המונעים שכפול HCV. באמצעות נהלים אלה הוצאנו את נוכחותו של גורם הביע constitutively או וירוס הנגרמת הדומיננטי שונים הכבד אי האנושי ב שורות תאים Murine כבד. Assay 1 מנתח בעיקר אם גורמים הגבלת...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen, קרלסרוהה, גרמניה </td><td> 41965-039 </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> Invitrogen, קרלסרוהה, גרמניה </td><td> 25030-024 </td></tr><tr><td> לא חיוניות חומצות אמינו </td><td> Invitrogen, קרלסרוהה, גרמניה </td><td> 11140-035 </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> Invitrogen, קרלסרוהה, גרמניה </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> העגל העובר סרום </td><td> PAA, Cölbe, גרמניה </td><td> A15151 </td></tr><tr><td> α-E2 (CBH23) </td><td> מספקים בנדיבותם של סטיבן Foung 10 </td><td></td></tr><tr><td> ה-ATP </td><td> סיגמא, שטיינהיים, גרמניה </td><td> A2833-106 </td></tr><tr><td> הגלוטתיון </td><td> סיגמא, שטיינהיים, גרמניה </td><td&gt; G4251-1G </td></tr><tr><td> Blasticidin </td><td> InVivo אלוף, סן דייגו, ארה&quot;ב </td><td> Ant-BL-1 </td></tr><tr><td> G418 (geneticin) </td><td> Invitrogen, קרלסרוהה, גרמניה </td><td> 11811-064 </td></tr><tr><td> פוליאתילן גליקול--1500 </td><td> רוש, מנהיים, גרמניה </td><td> 10783641001 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> רוט, קרלסרוהה, גרמניה </td><td> 0,335.3 </td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> רוט, קרלסרוהה, גרמניה </td><td> 3051.2 </td></tr><tr><td> עיזים סרום </td><td> סיגמא, שטיינהיים, גרמניה </td><td> G9023-5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> α-NS5A (9E10) </td><td> בתנאי חביב ידי צ&#39;ארלס רייס 7 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI (4 &quot;, 6&#39;-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) </td><td> Invitrogen </td><td> D1306 </td></tr><tr><td> אלקסה, פלואוריד 546 - אנטי אנושי עז IgG </td><td> Invitrogen, קרלסרוהה, גרמניה </td><td> A21089 </tד&gt; </tr><tr><td> אלקסה, פלואוריד 488 - עז נגד העכבר IgG </td><td> Invitrogen, קרלסרוהה, גרמניה </td><td> A10680 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen, קרלסרוהה, גרמניה </td><td> 11668-019 </td></tr><tr><td> CellTracker CMTMR </td><td> Invitrogen, קרלסרוהה, גרמניה </td><td> C2927 </td></tr><tr><td> CellTracker CMFDA </td><td> Invitrogen, קרלסרוהה, גרמניה </td><td> C2925 </td></tr><tr><td> Fluoromount </td><td> סיגמא, שטיינהיים, גרמניה </td><td> F4680-25ML </td></tr><tr><td> כל כימיקלים אחרים </td><td> רוט, קרלסרוהה, גרמניה </td><td></td></tr><tr><td> תרבית תאים חומרים </td><td> Sarstedt, Nümbrecht, גרמניה </td><td></td></tr></tbody></table>

two methods of heterokaryon formation to discover hcv restriction factors

הפטיטיס C (HCV) הוא וירוס hepatotropic עם טווח המארח מוגבל לבני אדם ושימפנזים. למרות שכפול HCV RNA נצפתה האדם שורות תאים בכבד שאינם ואת Murine, יעילות היה נמוך מאוד הדרושים לטווח ארוך הליכי הבחירה באמצעות HCV replicon בונה ביטוי הדומיננטיות לאנטיביוטיקה לבחירה סמנים 1-5. HCV במבחנה מחקר מוגבל ולכן האדם שורות תאים hepatoma מתירנית לכניסה וירוס השלמת מחזור החיים של נגיפי. בשל HCVs זיקה מינים צרה, אין מודל immunocompetent חיים קטן זמין המקיים את מחזור השכפול מלאה HCV 6-8. שכפול יעיל של HCV ב שאינם בני אדם בתאי למשל ממוצא העכבר סביר להניח עקב חוסר התאמה גנטית של חיוניות תלות בגורמים המארחות / או ביטוי של גורמים הגבלה. אנו בדקו האם ריבוי HCV מדוכאת על ידי fa הגבלת הדומיננטיתctors ב משני שורות תאים אנושיים שמקורם בכבד ללא רקמות או בכבד קווי עכבר סלולריים. לשם כך, פיתחנו שני עצמאיים תנאי השלמה חוצה שיטות בהסתמך על איחוי תאים סומטיים. בשני המקרים, סיום מחזור השכפול הנגיפי אפשרית רק את heterokaryons. כתוצאה מכך, השלמה מוצלחת טרנס, אשר נקבע על ידי מדידת ייצור דה נובו של הצאצאים ויראלית מדבקת, מצביע על העדר הגבלות דומיננטיים. באופן ספציפי, replicons HCV subgenomic הנושאים transgene בלוציפראז היו transfected אל מתירנית מאוד התאים hepatoma אדם (הא, 7.5 תאים). כתוצאה מכך, התאים הללו לשתף בתרבית התמזגו לתאים אנושיים Murine שונים להביע HCV הליבה חלבונים מבניים, מעטפה 1 ו - 2 (E1, E2) וחלבונים אביזר P7 ו NS2. ובלבד איחוי תאים יזם טיפול גליקול, פוליאתילן (PEG), תרבות פרסמה הרשות ויראלית מדבקתrticles אשר נגועים בתאי נאיביות באופן הקולטן תלוי. כדי להעריך את השפעת הגבלות הדומיננטיים על מחזור החיים המלא ויראלי כולל כניסת התא, RNA, שכפול תרגום והרכבה וירוס, אנחנו ניצלו את קו התא האנושי הכבד (הא-7 Lunet תאים נ 9), אשר אין ביטוי אנדוגני של CD81, גורם חיוני הכניסה של HCV. בהעדר CD81 הביע ectopically, תאים אלו הם בעצם עקשן לזיהום HCV 10. חשוב לציין, כאשר שיתוף תרבותי התמזגו עם תאים המבטאים CD81 האדם אבל חוסר לפחות תא אחר כניסת גורם מכריע (כלומר SR-BI, CLDN1, OCLN), רק את heterokaryons כתוצאה להציג את מערכת שלמה של גורמים כניסה HCV הנדרשים על זיהום. לכן, כדי לנתח אם הגורמים הדומיננטיים הגבלת לדכא את השלמת מחזור שכפול HCV, אנו התמזגו Lunet תאים N עם תאים שונים ממקור אנושי עכבר למלא מכה קריטית כאמורeria. כאשר שיתוף בתרבית תאים היו transfected עם חלבון fusogenic ביותר מעטפת הנגיף מוטציה של הנגיף מוקצף אב טיפוס (PFV 11) ו תיגר לאחר מכן עם זיהומיות חלקיקים (HCV HCVcc), דה נובו הייצור של הנגיף מדבק נצפתה. זה מצביע על כך HCV בהצלחה מחזור השכפול שלו heterokaryons ובכך פוסלים הגבלת הביטוי של גורמים דומיננטיים אלה שורות תאים. אלה מותנים השלמה הרומן חוצה שיטות יהיה שימושי למסך פאנל גדול של שורות תאים תאים ראשוניים לביטוי של HCV ספציפיים הגורמים הדומיננטיים הגבלה.

Watch this Scientific Journal Video about Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors at JoVE.com

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

נתאר שתי שיטות מותנה<em&gt; טראנס</em&gt;-השלמה של הפטיטיס C (HCV) הרכבה השלמת מחזור החיים המלא ויראלי, אשר מסתמכים על היווצרות heterokaryon. טכניקות אלו מתאימות למסך של שורות תאים המבטאים הגבלה גורמים דומיננטיים, אשר המונעים הייצור של הצאצאים HCV זיהומיות.

שתי שיטות של גיבוש Heterokaryon לגלות גורמים הגבלת HCV

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

שיטות להעריך מתווכת בטא מוות של תאים על ידי לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיות

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

הגבלת אנזים מבוסס שיבוט שיטה להערכה<em&gt; במבחנה</em&gt; יכולת שכפול של HIV-1 Gag-MJ4 וירוסי כימרי C סוג משנה

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

הקמה ואופטימיזציה של הגדרת תפוקה גבוהה ללמוד<em&gt; סטפילוקוקוס epidermidis</em&gt; ו<em&gt; Marinum Mycobacterium</em&gt; זיהום כמודל לגילוי תרופות

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations

שיטות להערכת Cytotoxicity ודיכוי חיסוני של תכשירי מוצרים דליקים טבק

Among other pathophysiological changes, chronic exposure to cigarette smoke causes inflammation and immune suppression, which have been linked to ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

לטווח ארוך Intravital multiphoton מיקרוסקופית הדמיה של תאים חיסוני בבריאים וחולה כבד באמצעות עכברים CXCR6.Gfp Reporter

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

שיטות כדי להגדיל את הרגישות של רזולוציה גבוהה התכה יחידה נוקלאוטיד פולימורפיזם Genotyping במלריה

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

יישום מערכת ביטוי עין מתנהלת לחקר הפרעות של גורמים בקטריאלי ארסיות עם איתות תאיים

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

שיטות לעכב קטריאלי Pyomelanin ייצור וקבעו את הגידול המקביל ברגישות לסטרס חמצונים

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

פענוח ופתוגנזה הדמיה והשתרגות<em&gt; Abscessus Mycobacterium</em&gt; בעוברי דג הזברה

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

שיטות כדי לחקור את תפקיד הרגולציה של RNA הקטן וריבוזומלי תפוסה של<em&gt; Falciparum Plasmodium</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...