Name: two methods of heterokaryon formation to discover hcv restriction factors
Uploaded: 2012-07-16T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors at JoVE.com

우리는 Takaji Waki​​ta 각각 JFH1 및 J6CF의 분리를위한 젠스 Bukh에 감사를드립니다. 아울러 우리는 찰스 허-7.5 세포에 대한 쌀과 9E10 항체, E2 특정 항체 CBH-23에 대한 스티븐 였어, 그리고 실험 바이러스학, 유용한 제안 및 토론을위한 Twincore학과의 모든 구성원 감사드립니다.

PEG에 의한 세포 융합 1. 세포 배양 <ol><li> 문화 허-7.5, HELA과 DMEM 전체 (DMEM cplt) 매체에서 15cm 세포 배양 접시에 순진하거나 포장 셀 라인에게 12 Hep56.1D, DMEM 2 MM L-글루타민, 1X 비 필수 아미노산, 100와 함께 보충 U / ML 페니실린, 100 μg / ML의 스트렙토 마이신,와 10 % 태아 송아지 혈청. 같은 표 1에 표시된 안정적인 세포 라인에 맞는 선택을 적용합니다. </li></ol><p ...

<ol>
	<li>Zhu, Q., Guo, J. T., Seeger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+hepatitis+C+virus+subgenomes+in+nonhepatic+epithelial+and+mouse+hepatoma+cells.">Replication of hepatitis C virus subgenomes in nonhepatic epithelial and mouse hepatoma cells.</a> J. Virol. 77, 9204-9210 (2003).</li><li>Kato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonhepatic+cell+lines+HeLa+and+293+support+efficient+replication+of+the+hepatitis+C+virus+genotype+2a+subgenomic+replicon.">Nonhepatic cell lines HeLa and 293 support efficient replication of the hepatitis C virus genotype 2a subgenomic replicon.</a> J. Virol. 79, 592-596 (2005).</li><li>Ali, S., Pellerin, C., Lamarre, D., Kukolj, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+subgenomic+replicons+in+the+human+embryonic+kidney+293+cell+line.">Hepatitis C virus subgenomic replicons in the human embryonic kidney 293 cell line.</a> J. Virol. 78, 491-501 (2004).</li><li>Date, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype+2a+hepatitis+C+virus+subgenomic+replicon+can+replicate+in+HepG2+and+IMY-N9+cells.">Genotype 2a hepatitis C virus subgenomic replicon can replicate in HepG2 and IMY-N9 cells.</a> J. Biol. Chem. 279, 22371-22376 (2004).</li><li>Chang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+hepatitis+C+virus+(HCV)+RNA+in+mouse+embryonic+fibroblasts:+protein+kinase+R+(PKR)-dependent+and+PKR-independent+mechanisms+for+controlling+HCV+RNA+replication+and+mediating+interferon+activities.">Replication of hepatitis C virus (HCV) RNA in mouse embryonic fibroblasts: protein kinase R (PKR)-dependent and PKR-independent mechanisms for controlling HCV RNA replication and mediating interferon activities.</a> J. Virol. 80, 7364-7374 (2006).</li><li>Zhong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+hepatitis+C+virus+infection+in+vitro.">Robust hepatitis C virus infection in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 9294-9299 (2005).</li><li>Lindenbach, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+replication+of+hepatitis+C+virus+in+cell+culture.">Complete replication of hepatitis C virus in cell culture.</a> Science. 309, 623-626 (2005).</li><li>Wakita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+infectious+hepatitis+C+virus+in+tissue+culture+from+a+cloned+viral+genome.">Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome.</a> Nat. Med. 11, 791-796 (2005).</li><li>Witteveldt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD81+is+dispensable+for+hepatitis+C+virus+cell-to-cell+transmission+in+hepatoma+cells.">CD81 is dispensable for hepatitis C virus cell-to-cell transmission in hepatoma cells.</a> J. Gen. Virol. 90, 48-58 (2009).</li><li>Bitzegeio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+hepatitis+C+virus+to+mouse+CD81+permits+infection+of+mouse+cells+in+the+absence+of+human+entry+factors.">Adaptation of hepatitis C virus to mouse CD81 permits infection of mouse cells in the absence of human entry factors.</a> PLoS Pathog. 6, e1000978 (2010).</li><li>Lindemann, D., Goepfert, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+foamy+virus+envelope+glycoproteins.">The foamy virus envelope glycoproteins.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 277, 111-129 (2003).</li><li>Brohm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+determinants+important+for+hepatitis+C+virus+p7+function+in+morphogenesis+by+using+trans-complementation.">Characterization of determinants important for hepatitis C virus p7 function in morphogenesis by using trans-complementation.</a> J. Virol. 83, 11682-11693 (2009).</li><li>Steinmann, E., Brohm, C., Kallis, S., Bartenschlager, R., Pietschmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+trans-encapsidation+of+hepatitis+C+virus+RNAs+into+infectious+virus-like+particles.">Efficient trans-encapsidation of hepatitis C virus RNAs into infectious virus-like particles.</a> J. Virol. 82, 7034-7046 (2008).</li><li>Koutsoudakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+early+steps+of+hepatitis+C+virus+infection+by+using+luciferase+reporter+viruses.">Characterization of the early steps of hepatitis C virus infection by using luciferase reporter viruses.</a> J. Virol. 80, 5308-5320 (2006).</li><li>Frentzen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Completion+of+hepatitis+C+virus+replication+cycle+in+heterokaryons+excludes+dominant+restrictions+in+human+non-liver+and+mouse+liver+cell+lines.">Completion of hepatitis C virus replication cycle in heterokaryons excludes dominant restrictions in human non-liver and mouse liver cell lines.</a> PLoS Pathog. 7, e1002029 (2011).</li><li>Lindemann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+particle-associated+glycoprotein+signal+peptide+essential+for+virus+maturation+and+infectivity.">A particle-associated glycoprotein signal peptide essential for virus maturation and infectivity.</a> J. Virol. 75, 5762-5771 (2001).</li><li>Blight, K. J., McKeating, J. A., Rice, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+permissive+cell+lines+for+subgenomic+and+genomic+hepatitis+C+virus+RNA+replication.">Highly permissive cell lines for subgenomic and genomic hepatitis C virus RNA replication.</a> J. Virol. 76, 13001-13014 (2002).</li></ol>

우리는 HCV 복제를 배제 지배적인 부정적인 제한 사항 분석을 위해 교양 세포 heterokaryon 형성을 유발하는 두 가지 방법을 제시. 이 절차를 사용하여 우리는 다양한 인간 이외의 간장 및 murine 간 세포 라인의 지배 constitutively 표현이나 바이러스 유발 요인의 존재를 제외. 제한 요인 전염성 자손의 HCV 조립 및 릴리스를 방지하는 경우 첫 번째 분석은 주로 분석합니다. 이 경우에는 포장 세포가 HCV replico...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen, 카를 스루에, 독일 </td><td> 41965-039 </td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> Invitrogen, 카를 스루에, 독일 </td><td> 25030-024 </td></tr><tr><td> 비 필수 아미노산 </td><td> Invitrogen, 카를 스루에, 독일 </td><td> 11140-035 </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Invitrogen, 카를 스루에, 독일 </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> 태아 송아지 혈청 </td><td> PAA, Cölbe, 독일 </td><td> A15151 </td></tr><tr><td> α-E2 (CBH23) </td><td> 친절 스티븐 였어 10 제공 </td><td></td></tr><tr><td> ATP </td><td> 시그마, Steinheim, 독일 </td><td> A2833-106 </td></tr><tr><td> 글루타티온 </td><td> 시그마, Steinheim, 독일 </td><td&gt; G4251-1G </td></tr><tr><td> Blasticidin </td><td> Invivo 세대, 샌디에고, 미국 </td><td> 개미-BL-1 </td></tr><tr><td> G418 (geneticin) </td><td> Invitrogen, 카를 스루에, 독일 </td><td> 11811-064 </td></tr><tr><td> 폴리에틸렌 - 글리콜-1500 </td><td> 로슈, 만하임, 독일 </td><td> 10783641001 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> 로스, 카를 스루에, 독일 </td><td> 0335.3 </td></tr><tr><td> 트리톤 X-100 </td><td> 로스, 카를 스루에, 독일 </td><td> 3051.2 </td></tr><tr><td> 염소 혈청 </td><td> 시그마, Steinheim, 독일 </td><td> G9023-5mL </td></tr><tr><td> α-NS5A (9E10) </td><td> 친절 찰스 쌀 7에 의해 제공 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI (4 &#39;, 6&#39;-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) </td><td> Invitrogen </td><td> D1306 </td></tr><tr><td> 알렉사 - 형석 546 - 염소 안티 - 인간 IgG </td><td> Invitrogen, 카를 스루에, 독일 </td><td> A21089 </tD&gt; </tr><tr><td> 알렉사 - 형석 488 - 염소 안티 - 마우스 IgG </td><td> Invitrogen, 카를 스루에, 독일 </td><td> A10680 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen, 카를 스루에, 독일 </td><td> 11668-019 </td></tr><tr><td> CellTracker CMTMR </td><td> Invitrogen, 카를 스루에, 독일 </td><td> C2927 </td></tr><tr><td> CellTracker CMFDA </td><td> Invitrogen, 카를 스루에, 독일 </td><td> C2925 </td></tr><tr><td> Fluoromount </td><td> 시그마, Steinheim, 독일 </td><td> F4680-25ML </td></tr><tr><td> 기타 모든 화학 물질 </td><td> 로스, 카를 스루에, 독일 </td><td></td></tr><tr><td> 세포 배양 자료 </td><td> Sarstedt, Nümbrecht, 독일 </td><td></td></tr></tbody></table>

two methods of heterokaryon formation to discover hcv restriction factors

C 형 간염 바이러스 (HCV)는 인간과 침팬지에 제한된 호스트 범위 hepatotropic 바이러스입니다. HCV RNA의 복제 인간이 아닌 간장과 murine 세포 라인에서 관찰되었지만, 효율이 매우 낮은이었고, HCV replicon을 사용하여 필요한 장기적인 선정 절차가 지배적인 항생제가 선택할 수있는 마커 1-5 구성하고 표현. 시험 관내 연구에서 HCV 따라서 바이러스 생활주기의 바이러스 항목과 완성을위한 허용 인간 간암 세포 라인으로 제한됩니다. 좁은 종의 tropism을 HCVs으로 인해 전체 HCV 복제주기에게 6-8 격려하고 사용할 수있는 면역 적격 작은 동물 모델이 없습니다. 마우스 원산지 예 비 인간의 세포에서 HCV의 비효율적인 복제 가능성 필수 호스트 종속 요소 및 / 또는 제한 요인의 표현의 유전자 호환성 부족으로 인한 것입니다. 우리는 HCV 전파가 지배적인 제한 FA에 의해 억압 받고 있는지 여부를 조사비 간장 조직이나 마우스 간 세포 라인에서 파생된 인간의 세포 라인 중의 ctors. 이를 위해, 우리는 체세포 융합에 의존하는 두 개의 독립적인 조건부 횡단 complementation 방법을 개발했습니다. 두 경우 모두, 바이러스 복제 사이클의 완성은 heterokaryons에서만 가능합니다. 따라서 전염성 바이러스 자손의 드 노보 생산을 측정하여 결정됩니다 성공 횡단 complementation은, 지배적인 규제의 부재를 나타냅니다. 특히, 루시페라제 transgene를 들고 subgenomic HCV replicons가 적극 허용 인간 간암 세포 (어 - 7.5 세포)로 transfected되었다. 그 후,이 세포들은 공동 배양해와 HCV 구조 단백질 코어, 봉투 1과 2 (E1, E2) 및 액세서리 단백질 P7과 NS2를 표현하는 다양한 인간과 murine 세포에 융합되었다. 세포 융합은 폴리에틸렌 글리콜 - (PEG)와 치료에 의해 시작되었다고 제공, 문화가 전염성 바이러스 PA를 출시수용체에 의존 방식으로 순진 세포를 감염 rticles. 셀 입력, RNA 번역, 복제 및 바이러스 조립을 포함한 완전한 바이러스 생활주기에 지배적인 제한의 영향을 평가하기 위해, CD81의 내생적인 표현이 부족 인간 간 세포주 (허-7 Lunet N 전지 9)을 이용했다 HCV의 필수 항목 계수. ectopically 표현 CD81의 부재에서 이러한 세포는 HCV 감염 10 ~ 근본적 내화물입니다. 중요한 것은 공동 배양해과 인간 CD81하지만 부족 적어도 또 다른 중요한 세포 엔트리 계수 (예 : SR-BI, CLDN1, OCLN)를 표현하는 세포와 융합 경우에만 결과 heterokaryons 감염에 대한 필요한 HCV 항목 요소의 전체 집합을 표시합니다. 따라서 지배적인 제한 요인 HCV 복제주기의 완성을 억제하는 경우에는 분석, 우리는 위에서 언급한 crit를 충족 인간 및 마우스 유래의 다양한 세포로 Lunet N 개의 세포를 융합eria. 공동 교양 세포 프로토 타입 거품 바이러스의 돌연변이 높은 fusogenic 바이러스성 봉투 단백질 (PFV 11)로 transfected하고 이후 감염 HCV 입자 (HCVcc)와 도전을 때, 전염성 바이러스의 드 노보 제작이 관찰되었다. 이것은 HCV가 성공적 따라서 이들 세포 라인에있는 지배적인 제한 요인의 표현을 배제 heterokaryons 년에 복제주기를 완료했음을 나타냅니다. 이 소설 조건부 횡단 complementation 방법 HCV 특정 지배적인 제한 요인의 표현을위한 셀 라인 및 기본 세포의 대형 패널을 구분할 도움이 될 것입니다.

Watch this Scientific Journal Video about Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors at JoVE.com

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

우리는 조건부를위한 두 가지 방법을 설명<em&gt; 트랜스</emC 형 간염 바이러스 (HCV) 조립 및 heterokaryon 형성에 의존하는 완전한 바이러스 생활주기의 완성&gt;-complementation. 이 기술은 감염 HCV 자손의 생산을 배제 지배적인 제한 요소를 표현하는 세포 라인을위한 화면으로 적합합니다.

Heterokaryon 형성의 두 가지 방법 HCV 제한 요소를 발견하기

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

세포 독성 T Lymphocytes에 의해 베타 세포 죽음의 중재를 평가하는 방법

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

연구

면역학 및 감염병학

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

제한 효소 기반의 복제 방법을 평가하기 위해<em&gt; 시험관</em&gt; HIV-1 서브 타입 C 개그 - MJ4 키메라 바이러스의 복제 능력

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

설립과 연구에 높은 처리량 설정 최적화<em&gt; 표피 포도 구균</em&gt;와<em&gt; Mycobacterium의 박테</em&gt; 감염 신약 개발의 모델로

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations

방법은 가연성 담배 제품 준비의 세포 독성 및 면역 억제를 평가하기

Among other pathophysiological changes, chronic exposure to cigarette smoke causes inflammation and immune suppression, which have been linked to ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

CXCR6.Gfp 기자 마우스를 사용하여 건강하고 병에 걸린 간에서 면역 세포의 장기 생체 내에 다중 광자 현미경 이미징

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

방법은 말라리아에 단일 염기 다형성 유전자형 녹는 고해상도의 감도를 증가

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

유도 발현 시스템을 적용하면 세포 내 신호와 세균 독성 요인의 간섭을 연구하기 위해

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

방법은 세균 Pyomelanin 생산을 억제하고 산화 스트레스에 감도에 대응 증가를 확인하는 방법

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

영상 병인과의 Cording를 해독하고<em&gt; 미코 농양</em&gt; Zebrafish의 배아에서

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

방법은 작은 RNA를과의 리보솜 점유 규제 역할을 조사하기 위해<em&gt; 말라리아 원충</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...