Name: two methods of heterokaryon formation to discover hcv restriction factors
Uploaded: 2012-07-16T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors at JoVE.com

Vi er takknemlige for Takaji Wakita og Jens Bukh for JFH1 og J6CF isolater, henholdsvis. Videre har vi takke Charles Rice til Huh-7.5 celler og 9E10 antistoff, Steven Foung for E2-spesifikt antistoff CBH-23, og alle medlemmer av Department of Experimental virologi, Twincore for nyttige innspill og diskusjoner.

Cell Fusion av PEG 1. Cell Culture <ol><li> Kultur Huh-7.5, HelÃ og Hep56.1D naive eller emballasjen cellelinjer 12 på 15 cm cellekultur retter i DMEM komplett (DMEM cplt) medium, supplert DMEM med 2 mm L-glutamin, 1x ikke-essensielle aminosyrer, 100 U / mL penicillin, 100 mikrogram / ml streptomycin, og 10% kalvefoster serum. Bruk passende valg til stabile cellelinjer som angitt i tabell 1. </li></ol> 2. Transfeksjon av HCV RNA <ol><li>...

<ol>
	<li>Zhu, Q., Guo, J. T., Seeger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+hepatitis+C+virus+subgenomes+in+nonhepatic+epithelial+and+mouse+hepatoma+cells.">Replication of hepatitis C virus subgenomes in nonhepatic epithelial and mouse hepatoma cells.</a> J. Virol. 77, 9204-9210 (2003).</li><li>Kato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonhepatic+cell+lines+HeLa+and+293+support+efficient+replication+of+the+hepatitis+C+virus+genotype+2a+subgenomic+replicon.">Nonhepatic cell lines HeLa and 293 support efficient replication of the hepatitis C virus genotype 2a subgenomic replicon.</a> J. Virol. 79, 592-596 (2005).</li><li>Ali, S., Pellerin, C., Lamarre, D., Kukolj, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+subgenomic+replicons+in+the+human+embryonic+kidney+293+cell+line.">Hepatitis C virus subgenomic replicons in the human embryonic kidney 293 cell line.</a> J. Virol. 78, 491-501 (2004).</li><li>Date, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype+2a+hepatitis+C+virus+subgenomic+replicon+can+replicate+in+HepG2+and+IMY-N9+cells.">Genotype 2a hepatitis C virus subgenomic replicon can replicate in HepG2 and IMY-N9 cells.</a> J. Biol. Chem. 279, 22371-22376 (2004).</li><li>Chang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+hepatitis+C+virus+(HCV)+RNA+in+mouse+embryonic+fibroblasts:+protein+kinase+R+(PKR)-dependent+and+PKR-independent+mechanisms+for+controlling+HCV+RNA+replication+and+mediating+interferon+activities.">Replication of hepatitis C virus (HCV) RNA in mouse embryonic fibroblasts: protein kinase R (PKR)-dependent and PKR-independent mechanisms for controlling HCV RNA replication and mediating interferon activities.</a> J. Virol. 80, 7364-7374 (2006).</li><li>Zhong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+hepatitis+C+virus+infection+in+vitro.">Robust hepatitis C virus infection in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 9294-9299 (2005).</li><li>Lindenbach, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+replication+of+hepatitis+C+virus+in+cell+culture.">Complete replication of hepatitis C virus in cell culture.</a> Science. 309, 623-626 (2005).</li><li>Wakita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+infectious+hepatitis+C+virus+in+tissue+culture+from+a+cloned+viral+genome.">Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome.</a> Nat. Med. 11, 791-796 (2005).</li><li>Witteveldt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD81+is+dispensable+for+hepatitis+C+virus+cell-to-cell+transmission+in+hepatoma+cells.">CD81 is dispensable for hepatitis C virus cell-to-cell transmission in hepatoma cells.</a> J. Gen. Virol. 90, 48-58 (2009).</li><li>Bitzegeio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+hepatitis+C+virus+to+mouse+CD81+permits+infection+of+mouse+cells+in+the+absence+of+human+entry+factors.">Adaptation of hepatitis C virus to mouse CD81 permits infection of mouse cells in the absence of human entry factors.</a> PLoS Pathog. 6, e1000978 (2010).</li><li>Lindemann, D., Goepfert, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+foamy+virus+envelope+glycoproteins.">The foamy virus envelope glycoproteins.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 277, 111-129 (2003).</li><li>Brohm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+determinants+important+for+hepatitis+C+virus+p7+function+in+morphogenesis+by+using+trans-complementation.">Characterization of determinants important for hepatitis C virus p7 function in morphogenesis by using trans-complementation.</a> J. Virol. 83, 11682-11693 (2009).</li><li>Steinmann, E., Brohm, C., Kallis, S., Bartenschlager, R., Pietschmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+trans-encapsidation+of+hepatitis+C+virus+RNAs+into+infectious+virus-like+particles.">Efficient trans-encapsidation of hepatitis C virus RNAs into infectious virus-like particles.</a> J. Virol. 82, 7034-7046 (2008).</li><li>Koutsoudakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+early+steps+of+hepatitis+C+virus+infection+by+using+luciferase+reporter+viruses.">Characterization of the early steps of hepatitis C virus infection by using luciferase reporter viruses.</a> J. Virol. 80, 5308-5320 (2006).</li><li>Frentzen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Completion+of+hepatitis+C+virus+replication+cycle+in+heterokaryons+excludes+dominant+restrictions+in+human+non-liver+and+mouse+liver+cell+lines.">Completion of hepatitis C virus replication cycle in heterokaryons excludes dominant restrictions in human non-liver and mouse liver cell lines.</a> PLoS Pathog. 7, e1002029 (2011).</li><li>Lindemann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+particle-associated+glycoprotein+signal+peptide+essential+for+virus+maturation+and+infectivity.">A particle-associated glycoprotein signal peptide essential for virus maturation and infectivity.</a> J. Virol. 75, 5762-5771 (2001).</li><li>Blight, K. J., McKeating, J. A., Rice, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+permissive+cell+lines+for+subgenomic+and+genomic+hepatitis+C+virus+RNA+replication.">Highly permissive cell lines for subgenomic and genomic hepatitis C virus RNA replication.</a> J. Virol. 76, 13001-13014 (2002).</li></ol>

Vi presenterer to metoder for å indusere heterokaryon formasjon i dyrkede celler for analysen av dominerende negative restriksjoner som utelukker HCV replikering. Ved hjelp av disse prosedyrene ekskludert vi tilstedeværelsen av en dominerende constitutively uttrykt eller virus-indusert faktor i ulike menneskelige ikke-leveren og i murine lever cellelinjer. Den første analysen analyserer primært om restriksjoner faktorer forebygge HCV montering og frigjøring av smittsomme avkom. Siden i dette tilfellet emballasje ce...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagensen </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland </td><td> 41965-039 </td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland </td><td> 25030-024 </td></tr><tr><td> Ikke-essensielle aminosyrer </td><td> Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland </td><td> 11140-035 </td></tr><tr><td> Penicillin / streptomycin </td><td> Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> Kalvefoster serum </td><td> PAA, Cölbe, Tyskland </td><td> A15151 </td></tr><tr><td> α-E2 (CBH23) </td><td> vennlig levert av Steven Foung 10 </td><td></td></tr><tr><td> ATP </td><td> Sigma, Steinheim, Tyskland </td><td> A2833-106 </td></tr><tr><td> Glutathione </td><td> Sigma, Steinheim, Tyskland </td><td&gt; G4251-1G </td></tr><tr><td> Blasticidin </td><td> Invivo Gen, San Diego, USA </td><td> Ant-BL-1 </td></tr><tr><td> G418 (geneticin) </td><td> Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland </td><td> 11811-064 </td></tr><tr><td> Polyetylen-glykol-1500 </td><td> Roche, Mannheim, Tyskland </td><td> 10783641001 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> Roth, Karlsruhe, Tyskland </td><td> 0335.3 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Roth, Karlsruhe, Tyskland </td><td> 3051.2 </td></tr><tr><td> Goat serum </td><td> Sigma, Steinheim, Tyskland </td><td> G9023-5ml </td></tr><tr><td> α-NS5A (9E10) </td><td> Vennlig levert av Charles Rice 7 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI (4 &#39;, 6&#39;-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) </td><td> Invitrogen </td><td> D1306 </td></tr><tr><td> Alexa-Fluor 546 - goat anti-human IgG </td><td> Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland </td><td> A21089 </td&gt; </tr><tr><td> Alexa-Fluor 488 - goat anti-mus IgG </td><td> Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland </td><td> A10680 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland </td><td> 11668-019 </td></tr><tr><td> CellTracker CMTMR </td><td> Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland </td><td> C2927 </td></tr><tr><td> CellTracker CMFDA </td><td> Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland </td><td> C2925 </td></tr><tr><td> Fluoromount </td><td> Sigma, Steinheim, Tyskland </td><td> F4680-25ML </td></tr><tr><td> Alle andre kjemikalier </td><td> Roth, Karlsruhe, Tyskland </td><td></td></tr><tr><td> Cellekultur materialer </td><td> Sarstedt, Nümbrecht, Tyskland </td><td></td></tr></tbody></table>

two methods of heterokaryon formation to discover hcv restriction factors

Hepatitt C virus (HCV) er en hepatotropic virus med en host-range begrenset til mennesker og sjimpanser. Selv om HCV RNA replikasjon har blitt observert i humane ikke-hepatiske og murine cellelinjer, var effektiviteten svært lav og nødvendige langsiktige valg prosedyrer ved hjelp HCV replikonet konstruerer uttrykke dominerende antibiotika-valgbare markører 1-5. HCV in vitro forskning er derfor begrenset til menneskelige hepatoma cellelinjer ettergivende for virus oppføring og ferdigstillelse av viral livssyklus. Grunnet HCVs smal arter tropisme, er det ingen immunkompetente liten dyremodell tilgjengelig som opprettholder hele HCV replikering syklus 6-8. Ineffektiv replikering av HCV i ikke-menneskelige celler f.eks av mus opprinnelse er sannsynligvis på grunn av manglende genetisk uforlikelighet av essensielle vert avhengighet faktorer og / eller uttrykket av restriksjonsenzymer faktorer. Vi undersøkte om HCV forplantning undertrykt av dominerende begrensning factors i enten humane cellelinjer avledet fra ikke-hepatiske vev eller i mus lever cellelinjer. For dette formålet har vi utviklet to uavhengige betingede trans-complementation metoder baserer seg på somatisk celle fusjon. I begge tilfeller er fullføring av virusreplikasjon syklusen bare mulig i heterokaryons. Følgelig indikerer vellykket trans-complementation, som bestemmes ved å måle de novo produksjon av smittsom viral avkom, fravær av dominerende restriksjoner. Spesielt ble subgenomic HCV replikon bærer en luciferase transgenet tilført i svært ettergivende humane hepatoma celler (Huh-7.5 celler). Senere ble disse cellene samtidig kultivert og smeltet sammen til ulike menneskelige og murine celler uttrykker HCV strukturelle proteiner kjerne, konvolutt 1 og 2 (E1, E2) og tilbehør proteiner P7 og ns2. Forutsatt at cellen fusjon ble initiert av behandling med polyetylen-glykol (PEG), utgitt kulturen smittsom viral particles som smittet naive celler i en reseptor-avhengig måte. For å vurdere påvirkning av dominerende restriksjoner på hele viral livssyklus inkludert celleoppføring, RNA oversettelse, replikering og virus montering, tok vi fordel av et menneske lever cellelinje (Huh-7 Lunet N celler 9) som mangler endogene uttrykk av CD81, en vesentlig faktor oppføring av HCV. I fravær av ectopically uttrykte CD81, disse cellene er i hovedsak ildfast til HCV smitte 10. Viktigere, ved samtidig kultivert og smeltet sammen med celler som uttrykker menneskelig CD81 men mangel på minst en annen viktig celleoppføring faktor (dvs. SR-BI, CLDN1, OCLN), bare de resulterende heterokaryons vise komplett sett av HCV oppføring faktorer nødvendige for infeksjon. Derfor, for å analysere om dominerende restriksjoner faktorer undertrykke ferdigstillelse av HCV replikering syklusen, smeltet vi Lunet N celler med ulike celler fra mennesker og mus opprinnelse som oppfyller ovennevnte critEria. Når co-dyrkede celler ble tilført med en svært fusogenic viruskapselen protein mutant av prototypen skummende virus (PFV 11) og deretter utfordret med smittsomme HCV partikler (HCVcc), ble de novo produksjon av smittsomme virus observert. Dette indikerer at HCV fullført sin replikering syklus i heterokaryons dermed utelukker uttrykk for dominerende restriksjoner faktorer i disse cellelinjer. Disse romanen betingede trans-complementation metoder vil være nyttig for å skjerme en stor panel av cellelinjer og primære celler for uttrykk av HCV-spesifikke dominerende restriksjoner faktorer.

Watch this Scientific Journal Video about Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors at JoVE.com

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

Vi beskriver to metoder for betinget<em&gt; Trans</em&gt;-Complementation av hepatitt C-virus (HCV) montering og ferdigstillelse av hele viral livssyklus, som er avhengige av heterokaryon formasjon. Disse teknikkene er egnet for screening av cellelinjer som uttrykker dominerende restriksjoner faktorer, som utelukker produksjon av smittsomme HCV avkom.

To metoder for Heterokaryon Dannelse å oppdage HCV Restriction faktorer

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

Et restriksjonsenzym Basert Cloning metode for å vurdere den<em&gt; In vitro</em&gt; Replication Kapasitet av HIV-1 Undertype C gag-MJ4 Chimerisk virus

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Etablering og optimalisering av en høy gjennomstrømning Oppsett for å studere<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Og<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infeksjon som en modell for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations

Metoder for å evaluere Cytotoksisitet og Immunsuppresjon av Brenntobakksprodukt Forberedelser

Among other pathophysiological changes, chronic exposure to cigarette smoke causes inflammation and immune suppression, which have been linked to ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Long Term intra multiphoton Mikros Imaging av immunceller i friske og syke leveren Bruke CXCR6.Gfp Reporter Mus

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

Metoder for å øke følsomheten av High Resolution Melting Enkelt nucleotide polymorphism Genotyping i Malaria

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

Påføre en induserbar Expression System for å studere forstyrrelser av bakteriell virulensfaktorer med intracellulære signal

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Metoder for å hemme bakterie Pyomelanin Produksjon og Bestem tilsvarende økning i Følsomhet for oksidativt stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Tyde og Imaging Patogenese og snor av<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; I sebrafisk embryo

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Metoder for å undersøke om forskrifter rolle Små RNA og Ribosomalt Kapasitet av<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...