Name: isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions
Uploaded: 2012-08-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions at JoVE.com

Wij danken Dr Pina Colarusso en de live cell imaging faciliteit voor hun hulp bij beeldvorming en beeldanalyse, mevrouw Lailey voor haar technische bijstand, en eenheid 51 aan de voet Hospital in Calgary, AB voor het verstrekken van de menselijke navelstrengen. Dr KD Patel is een Alberta innoveert: Health Solutions Scientist. Dit werk werd ondersteund door een exploitatiesubsidie ​​van de Canadese Institutes for Health Research en uitrusting en infrastructuur subsidies van de Canadese Stichting voor Innovatie en de Alberta Wetenschap en Onderzoek Autoriteit.

1. Isolatie en onderhoud van de Mens vasculaire endotheelcellen <ol><li> Niveau 2 bioveiligheid procedures moeten worden gebruikt bij het werken met menselijk bloed en weefsel. Met een schaar knippen de stekker uit de placenta en dan nauw aan het snoer te onderzoeken voor de vorming van bloedstolsels en schade veroorzaakt door het klemmen van het snoer tijdens de bevalling. Knip en gooi deze gedeelten van het snoer. </li><li> Bereid collagenase oplossing bij 1 mg / ml door het gieten van 50 ml warme snoer buffer in ee...

<ol>
	<li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).</li><li>Diacovo, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+rolling,+arrest,+and+transmigration+across+activated,+surface-adherent+platelets+via+sequential+action+of+P-selectin+and+the+beta+2-integrin+CD11b/CD18.">Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-adherent platelets via sequential action of P-selectin and the beta 2-integrin CD11b/CD18.</a> Blood. 88, 146-157 (1996).</li><li>Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Petri, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+LSP1+is+involved+in+endothelial+dome+formation,+minimizing+vascular+permeability+changes+during+neutrophil+transmigration+in+vivo.">Endothelial LSP1 is involved in endothelial dome formation, minimizing vascular permeability changes during neutrophil transmigration in vivo.</a> Blood. 117, 942-952 (2011).</li><li>Chavakis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+junctional+adhesion+molecule-C+promotes+neutrophil+transendothelial+migration+in+vitro+and+in+vivo.">The junctional adhesion molecule-C promotes neutrophil transendothelial migration in vitro and in vivo.</a> J. Biol. Chem. 279, 55602-55608 (2004).</li><li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Isolation+Protocol.">Neutrophil Isolation Protocol.</a> J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).</li><li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+leukocyte+transmigration:+cell+surface+interactions+and+signaling+events.">Regulation of leukocyte transmigration: cell surface interactions and signaling events.</a> J. Immunol. 172, 7-13 (2004).</li><li>Alcaide, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+recruitment+under+shear+flow:+it's+all+about+endothelial+cell+rings+and+gaps.">Neutrophil recruitment under shear flow: it's all about endothelial cell rings and gaps.</a> Microcirculation. 16, 43-57 (2009).</li><li>Jutila, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+neutrophil+adhesion+under+conditions+mimicking+blood+flow.">Measurement of neutrophil adhesion under conditions mimicking blood flow.</a> Neutrophil Methods and Protocols. 412, 239-256 (2007).</li><li>Cuvelier, S. L., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+leukocyte+rolling+and+adhesion+in+vitro+under+flow+conditions.">Studying leukocyte rolling and adhesion in vitro under flow conditions.</a> Basic Cell Culture Protocols. 290, 331-342 (2005).</li><li>Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Physiologic+E-Selectin-Mediated+Leukocyte+Rolling+on+Microvascular+Endothelium.">Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium.</a> J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).</li><li>Petzelbauer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+dermal+microvascular+endothelial+cell+antigen+expression+and+cytokine+responsiveness+in+situ+and+in+cell+culture.">Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture.</a> J. Immunol. 151, 5062-5072 (1993).</li><li>Bonder, C. S., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+leukocyte+recruitment+to+splanchnic+organs+to+reduce+inflammation.">Modulating leukocyte recruitment to splanchnic organs to reduce inflammation.</a> Am J Phys - Gastrointestinal and Liver Phys. 284, G729-G733 (2003).</li><li>Cuvelier, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eosinophil+adhesion+under+flow+conditions+activates+mechanosensitive+signaling+pathways+in+human+endothelial+cells.">Eosinophil adhesion under flow conditions activates mechanosensitive signaling pathways in human endothelial cells.</a> J. Exp. Med. 202, 865-876 (2005).</li><li>Massia, S. P., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+endothelial+cell+interactions+with+surface-coupled+adhesion+peptides+on+a+nonadhesive+glass+substrate+and+two+polymeric+biomaterials.">Human endothelial cell interactions with surface-coupled adhesion peptides on a nonadhesive glass substrate and two polymeric biomaterials.</a> J. Biomed. Mat. Res. 25, 223-242 (1991).</li></ol>

<html> Onderzoekers hebben routinematig gebruikt endotheelcellen van verschillende vasculaire bedden tot neutrofielen werving en transmigratie te bestuderen. Voorbeelden omvatten, maar zijn niet beperkt tot, dermale microvasculaire endotheliale cellen 12, lever sinusoïdale endotheelcellen 13 en endotheelcellen van humane umbilicale ader 10. Onder hen HUVEC opgedaan grote populariteit vanwege hun relatieve gemak van isolatie en beschikbaarheid. HUVEC zijn een krachtig in vitro mo...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens en Apparatuur </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Collagenase type 1 </td><td> Worthington </td><td> 4197 </td><td></td></tr><tr><td> Cord buffer </td><td></td><td></td><td> Samenstelling: 140 mM NaCl 4 mM KCl 10 mM D-glucose in 1 mM NaH 2 PO 4 / Na 2 HPO 4 buffer bij pH 7,4 </td></tr><tr><td> Endotheelcellen Media (ECM) </td><td></td><td></td><td> M199 aangevuld met Eagle zouten met 16% humaan serum met 100 eenheden penicilline 100 mg streptomycine en 0,3 mg L-glutamine/ml </td></tr><tr><td> M199 </td><td> GIBCO </td><td> 31100-035 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilline Streptomycine glutamaat (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 10378-016 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Ibidi kamers </td><td> Ibidi </td><td> 80606 </td><td></td></tr><tr><td> TNF-α </td><td> PrePro Tech </td><td> 300 01A </td><td></td></tr><tr><td> Menselijke albumine 20% oplossing </td><td> Gemini Bioproducts </td><td> 800120050 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS zonder Ca2 + en Mg2 + </td><td> Sigma </td><td> H2487-10X </td><td></td></tr><tr><td> HBSS met Ca2 + en Mg2 + </td><td> Sigma </td><td> H1387-10X </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions

Neutrofielen zijn de meest voorkomende type witte bloedcel. Ze vormen een belangrijk deel van het aangeboren immuunsysteem 1. Tijdens de acute ontsteking van de neutrofielen, zijn de eerste inflammatoire cellen om te migreren naar de plaats van verwonding. Aanwerving van neutrofielen een blessure site is een stapsgewijs proces dat eerste, verwijding van de bloedvaten om de bloedstroom te verhogen omvat, ten tweede, microvasculaire structurele veranderingen en te ontsnappen van de plasma-eiwitten uit de bloedbaan, ten derde, walsen, adhesie en transmigratie van de neutrofielen over de endotheel en vierde accumulatie van neutrofielen op de plaats van schade 2,3. Een breed scala van in vivo en in vitro-methoden heeft ontwikkeld tot de studie van deze processen 4 mogelijk te maken. Deze methode richt zich op neutrofielen transmigratie in humane endotheelcellen. Een populaire methode voor de behandeling van de moleculaire processen die betrokken zijn bij neutrofielen transmigratie maakt gebruik van de menselijke neutrophils interactie met primaire humane umbilicale ader endotheel cellen (HUVEC) 5. Neutrofielen isolatie is visueel elders 6 beschreven; dus dit artikel zal de methode aan te tonen voor isolatie van HUVEC. Eenmaal geïsoleerd en gekweekt tot confluentie worden endotheelcellen geactiveerd waardoor de regulatie van adhesie en activering moleculen. Bijvoorbeeld activering van endotheelcellen met cytokines, zoals TNF-α resulteert in hogere E-selectine en IL-8 expressie 7. E-selectine bemiddelt vangen en rolling van neutrofielen en IL-8 bemiddelt activering en stevige hechting van neutrofielen. Na hechting neutrofielen transmigreren. Transmigratie kan paracellularly voorkomen (door middel van endotheelcellen knooppunten) of transcellularly (via de endotheelcellen zelf). In de meeste gevallen zijn deze interacties plaatsvinden onder stroom staat in het vaatstelsel 7,8. De parallelle plaat flow kamer is een veel gebruikt systeem dat mimics de hydrodynamische schuifspanningen gevonden in vivo en in staat stelt de studie van de neutrofielen rekrutering onder stroom staat in vitro 9,10. Verschillende bedrijven produceren parallelle plaat flow kamers en hebben elk voor-en nadelen. Als fluorescerende beeldvorming nodig is glas of een soortgelijk optisch polymeer moet worden gebruikt. Endotheelcellen niet goed groeien op glas. Hier presenteren we een eenvoudige en snelle methode voor fase-contrast, DIC en fluorescerende beeldvorming van neutrofielen transmigratie het gebruik van een laag volume ibidi kanaal glijbaan van een polymeer die ondersteuning biedt voor de snelle hechting en de groei van menselijke endotheelcellen en heeft optische eigenschappen die vergelijkbaar zijn met glas. In deze methode werden endotheelcellen gekweekt en gestimuleerd een ibidi μslide. Neutrofielen werden geïntroduceerd onder stromingscondities en transmigratie werd beoordeeld. Fluorescerende beeldvorming van de knooppunten in staat real-time bepaling van de omvang van paracellulaire versustranscellulair transmigratie.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions at JoVE.com

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

In dit artikel wordt eerst een procedure voor het isoleren van humane endotheelcellen van de navelstreng aderen en dan laat zien hoe deze cellen te gebruiken om neutrofielen transmigratie onderzoeken op stromingscondities. Door een laag volume stromingskamer gemaakt van een polymeer met de optische eigenschappen van glas levende cellen fluorescerende beeldvorming zeldzame celpopulaties is ook mogelijk.

Isolatie van humane navelstreng endotheel cellen en hun gebruik in de studie van de neutrofielen transmigratie onder stroomtoestanden

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kwantitatief<em&gt; In vitro</em&gt; Assay om neutrofieladhesie Maatregel om Activated primaire humane microvasculaire endotheelcellen onder statische omstandigheden

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Een Flow adhesieanalyse om te studeren leukocyten rekrutering van humane lever Sinusvormige endotheel onder omstandigheden van Afschuifspanning

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Human Neutrophil Flow Kamer adhesietest

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Real-time beeldvorming van endotheelcellen-cel Junctions Tijdens Neutrophil Transmigration onder fysiologische Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In vitro en in vivo model voor Bacteriële hechting aan de vaatwand Onder Flow omstandigheden te bestuderen

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

Het gebruik van flowcytometrie om de staat van chromatine in T-cellen Assess

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofielen Isolatie en analyse van hun rol in de Lymphoma Cell Gevoeligheid voor therapeutische middelen te bepalen

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

Kwantificering van monocyt zielsverhuizing en schuim celvorming van personen met chronische inflammatoire aandoeningen

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolatie en In Vitro cultuur van lymfkliertest en menselijke alveolaire macrofagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

Gelijktijdige studie van de aanwerving van monocyt subpopulaties onder stroom In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...