Name: isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions
Uploaded: 2012-08-08T13:00:00
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Wir danken Dr. Pina Colarusso und das Live Cell Imaging Facility für ihre Unterstützung bei der Bildgebung und Bildanalyse; Frau Lailey für ihre technische Hilfe; und Einheit 51 an den Ausläufern Hospital in Calgary, AB für die Bereitstellung von menschlichen Nabelschnur. Dr. KD Patel ist eine Alberta Innovates: Health Solutions Scientist. Diese Arbeit wurde durch einen Betriebskostenzuschuss von der kanadischen Institutes for Health Research und Ausrüstung und Infrastruktur Zuschüsse von der kanadischen Stiftung für Innovation und dem Alberta Behörde für Wissenschaft und Forschung unterstützt.

1. Isolierung und Erhaltung des menschlichen vaskulären Endothelzellen <ol><li> Biosafety Level 2 Verfahren müssen bei der Arbeit mit menschlichem Blut und Gewebe werden. Mit einer Schere durchschnitt die Nabelschnur aus der Plazenta und dann genau untersuchen Sie das Kabel für Blutgerinnsel und Schäden, die durch Spannen Sie das Kabel während der Geburt verursacht werden. Schneiden Sie und entsorgen Sie diese Teile des Rückenmarks. </li><li> Ansetzen Kollagenase-Lösung mit 1 mg / ml durch Gießen 50 ml warmem ...

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	<li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).</li><li>Diacovo, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+rolling,+arrest,+and+transmigration+across+activated,+surface-adherent+platelets+via+sequential+action+of+P-selectin+and+the+beta+2-integrin+CD11b/CD18.">Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-adherent platelets via sequential action of P-selectin and the beta 2-integrin CD11b/CD18.</a> Blood. 88, 146-157 (1996).</li><li>Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Petri, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+LSP1+is+involved+in+endothelial+dome+formation,+minimizing+vascular+permeability+changes+during+neutrophil+transmigration+in+vivo.">Endothelial LSP1 is involved in endothelial dome formation, minimizing vascular permeability changes during neutrophil transmigration in vivo.</a> Blood. 117, 942-952 (2011).</li><li>Chavakis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+junctional+adhesion+molecule-C+promotes+neutrophil+transendothelial+migration+in+vitro+and+in+vivo.">The junctional adhesion molecule-C promotes neutrophil transendothelial migration in vitro and in vivo.</a> J. Biol. Chem. 279, 55602-55608 (2004).</li><li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Isolation+Protocol.">Neutrophil Isolation Protocol.</a> J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).</li><li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+leukocyte+transmigration:+cell+surface+interactions+and+signaling+events.">Regulation of leukocyte transmigration: cell surface interactions and signaling events.</a> J. Immunol. 172, 7-13 (2004).</li><li>Alcaide, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+recruitment+under+shear+flow:+it's+all+about+endothelial+cell+rings+and+gaps.">Neutrophil recruitment under shear flow: it's all about endothelial cell rings and gaps.</a> Microcirculation. 16, 43-57 (2009).</li><li>Jutila, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+neutrophil+adhesion+under+conditions+mimicking+blood+flow.">Measurement of neutrophil adhesion under conditions mimicking blood flow.</a> Neutrophil Methods and Protocols. 412, 239-256 (2007).</li><li>Cuvelier, S. L., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+leukocyte+rolling+and+adhesion+in+vitro+under+flow+conditions.">Studying leukocyte rolling and adhesion in vitro under flow conditions.</a> Basic Cell Culture Protocols. 290, 331-342 (2005).</li><li>Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Physiologic+E-Selectin-Mediated+Leukocyte+Rolling+on+Microvascular+Endothelium.">Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium.</a> J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).</li><li>Petzelbauer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+dermal+microvascular+endothelial+cell+antigen+expression+and+cytokine+responsiveness+in+situ+and+in+cell+culture.">Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture.</a> J. Immunol. 151, 5062-5072 (1993).</li><li>Bonder, C. S., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+leukocyte+recruitment+to+splanchnic+organs+to+reduce+inflammation.">Modulating leukocyte recruitment to splanchnic organs to reduce inflammation.</a> Am J Phys - Gastrointestinal and Liver Phys. 284, G729-G733 (2003).</li><li>Cuvelier, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eosinophil+adhesion+under+flow+conditions+activates+mechanosensitive+signaling+pathways+in+human+endothelial+cells.">Eosinophil adhesion under flow conditions activates mechanosensitive signaling pathways in human endothelial cells.</a> J. Exp. Med. 202, 865-876 (2005).</li><li>Massia, S. P., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+endothelial+cell+interactions+with+surface-coupled+adhesion+peptides+on+a+nonadhesive+glass+substrate+and+two+polymeric+biomaterials.">Human endothelial cell interactions with surface-coupled adhesion peptides on a nonadhesive glass substrate and two polymeric biomaterials.</a> J. Biomed. Mat. Res. 25, 223-242 (1991).</li></ol>

<html> Forscher haben routinemäßig Endothelzellen aus verschiedenen Gefäßbetten zur Rekrutierung von Neutrophilen und Seelenwanderung zu studieren. Beispiele umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, dermale mikrovaskuläre Endothelzellen 12, Leber sinusoidalen Endothelzellen 13 und Endothelzellen aus menschlichen Nabelvene 10 begrenzt. Unter ihnen HUVEC gewonnen großer Beliebtheit wegen ihrer relativen Einfachheit der Isolation und Verfügbarkeit. HUVEC sind eine starke In-vitr...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagenzien und Geräte </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Collagenase Typ 1 </td><td> Worthington </td><td> 4197 </td><td></td></tr><tr><td> Cord-Puffer </td><td></td><td></td><td> Zusammensetzung: 140 mM NaCl 4 mM KCl 10 mM D-Glucose in 1 mM NaH 2 PO 4 / Na 2 HPO 4-Puffer bei pH 7,4 </td></tr><tr><td> Endothelial Cell Medien (ECM) </td><td></td><td></td><td> M199 mit Adler-Salzen mit 16% Humanserum mit 100 Einheiten Penicillin 100 ug Streptomycin und 0,3 mg L-glutamine/ml ergänzt </td></tr><tr><td> M199 </td><td> GIBCO </td><td> 31100-035 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin Streptomycin Glutamat (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 10378-016 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Ibidi Kammern </td><td> Ibidi </td><td> 80606 </td><td></td></tr><tr><td> TNF-α </td><td> Prepro Tech </td><td> 300-01A </td><td></td></tr><tr><td> Human Albumin 20% ige Lösung </td><td> Zwillinge Bioproducts </td><td> 800120050 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS ohne Ca 2 + und Mg 2 + </td><td> Sigma </td><td> H2487-10X </td><td></td></tr><tr><td> HBSS mit Ca 2 + und Mg 2 + </td><td> Sigma </td><td> H1387-10X </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions

Neutrophile sind die am häufigsten vorkommende Art von weißen Blutkörperchen. Sie bilden einen wesentlichen Teil des angeborenen Immunsystems ein. Während der akuten Entzündung, Neutrophile sind die ersten Entzündungszellen an der Stelle der Verletzung zu migrieren. Rekrutierung von Neutrophilen an eine verletzte Stelle ist ein schrittweiser Prozess, der erste, Erweiterung der Blutgefäße, um den Blutfluss zu erhöhen beinhaltet, zweitens mikrovaskulären strukturellen Veränderungen und die Flucht von Plasmaproteinen aus der Blutbahn, drittens, Walzgut, Adhäsion und Transmigration der neutrophilen Granulozyten über die Endothel, und eine vierte Akkumulation von Neutrophilen an der Stelle der Verletzung 2,3. Eine Vielzahl von in vivo und in vitro-Methoden entwickelt hat, das Studium dieser Prozesse 4 ermöglichen. Diese Methode konzentriert sich auf die Transmigration neutrophiler über menschliche Endothelzellen. Eine beliebte Methode zur Untersuchung der molekularen Vorgänge in neutrophilen Transmigration beteiligt nutzt menschliche neutrophils Interaktion mit primären humanen Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) 5. Neutrophile isoliert wurde optisch an anderer Stelle 6 beschrieben, so wird dieser Artikel die Methode zur Isolierung von HUVEC zeigen. Wenn sie einmal isoliert und bis zur Konfluenz werden die aktivierten Endothelzellen, was zur Hochregulierung von Adhäsion und Aktivierung Moleküle. Zum Beispiel, Aktivierung von Endothelzellen mit Cytokinen wie TNF-α zu einer erhöhten E-Selectin und IL-8-Expression 7. E-Selektin vermittelt Abscheidung und-rollen von Neutrophilen und IL-8 vermittelt die Aktivierung und feste Adhäsion von Neutrophilen. Nach Adhäsion Neutrophilen transmigrieren. Transmigration kann paracellularly auftreten (durch Endothelzellverbindungen) oder transzellulär (durch die Endothelzellen selbst). In den meisten Fällen treten diese Wechselwirkungen unter Strömungsverhältnisse im Gefäßsystem 7,8 gefunden. Die parallele Platte Flusskammer ist ein weit verbreitetes System, dass miMikrofone der hydrodynamische Schubspannungen in vivo gefunden und die Untersuchung der Rekrutierung von Neutrophilen unter Strömungsbedingungen in vitro 9,10. Mehrere Unternehmen produzieren parallele Platte Strömungskammern und haben jeweils Vor-und Nachteile. Wenn Fluoreszenz-Bildgebung erforderlich ist, muss Glas oder einem optisch ähnlichen Polymer verwendet werden. Endothelzellen nicht so wachsen wie auf Glas. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache und schnelle Methode zur Phasenkontrast-, DIC-und Fluoreszenz-Imaging von neutrophilen Transmigration mit einem geringen Volumen ibidi Kanal Rutsche aus einem Polymer, dass die rasche Adhäsion und das Wachstum von humanen Endothelzellen unterstützt und verfügt über optische Eigenschaften, die vergleichbar sind gemacht Glas. Bei diesem Verfahren wurden Endothelzellen wachsen und stimuliert einen ibidi μslide. Neutrophile wurden unter Strömungsbedingungen eingeführt und Transmigration beurteilt. Fluoreszenz-Imaging der Übergänge ein Echtzeit-Bestimmung des Ausmaßes der parazellulären gegenübertranszellulären Seelenwanderung.

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Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Dieser Artikel beschreibt zunächst ein Verfahren zur Isolierung von humanen Endothelzellen aus Nabelschnur-Venen und zeigt dann, wie man diese Zellen verwenden, um Transmigration neutrophiler unter Strömungsbedingungen zu untersuchen. Durch die Verwendung eines geringen Mengen Strömungskammer aus einem Polymer mit den optischen Eigenschaften des Glases hergestellt ist, ist in lebenden Zellen Fluoreszenz-Bildgebung von seltenen Zellpopulationen möglich.

Isolierung von humanen Nabelschnur-Endothelzellen und ihre Verwendung in der Studie von neutrophilen Transmigration unter Strömungsbedingungen

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assay auf Neutrophile Haftung auf Aktiviert primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter statischen Bedingungen messen

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Ein Flow-Assay zur Haftung Leukozyten-Rekrutierung Human Lebersinus Endothel unter den Bedingungen der Schubspannung Studieren

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Humanen neutrophilen Flusskammer Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Echtzeit-Bildgebung von Zell-Zell-Endothelial Junctions Während Neutrophile Transmigration unter physiologischen Fluss

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In-vitro- und In-vivo-Modell, um die bakterielle Adhäsion an der Gefäßwand unter Strömungsbedingungen Studieren

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

Die Verwendung von Durchflusszytometrie, um den Zustand von Chromatin in T-Zellen bewerten

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

Quantifizierung der Monocyte Seelenwanderung und Schaumbildung Zelle von Personen mit chronischen entzündlichen Erkrankungen

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation und In-vitro- Kultur von murinen und menschlichen alveoläre Makrophagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

Gleichzeitige Untersuchung der Rekrutierung von Monocyte Subpopulationen unter Strömung In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...