Name: isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions
Uploaded: 2012-08-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions at JoVE.com

Vi takker Dr. Pina Colarusso og Live Cell Imaging Facility for deres assistanse med bildebehandling og bildeanalyse, Ms Lailey for henne teknisk assistanse, og enhet 51 ved foten Hospital i Calgary, AB for å gi menneskelige navle snorer. Dr. KD Patel er en Alberta innovates: Health Solutions Scientist. Dette arbeidet ble støttet av en driftsstøtte fra det kanadiske Institutes for Health Research og utstyr og infrastruktur tilskudd fra det kanadiske Foundation for innovasjon og Alberta vitenskap og forskning Authority.

1. Isolering og vedlikehold av human vaskulær endotelceller <ol><li> Nivå 2 biologisk prosedyrer må brukes når du arbeider med humant blod og vev. Bruke saks klippe ledningen fra morkaken og deretter nøye undersøke ledningen for blodpropp og skader forårsaket av klemming ledningen ved levering. Klipp ut og kaste slike deler av ledningen. </li><li> Forbered frisk collagenase løsning på 1 mg / ml ved å helle 50 ml varm ledningen buffer til et rør som inneholder 50 mg collagenase. </li><li> Endre til sterile h...

<ol>
	<li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).</li><li>Diacovo, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+rolling,+arrest,+and+transmigration+across+activated,+surface-adherent+platelets+via+sequential+action+of+P-selectin+and+the+beta+2-integrin+CD11b/CD18.">Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-adherent platelets via sequential action of P-selectin and the beta 2-integrin CD11b/CD18.</a> Blood. 88, 146-157 (1996).</li><li>Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Petri, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+LSP1+is+involved+in+endothelial+dome+formation,+minimizing+vascular+permeability+changes+during+neutrophil+transmigration+in+vivo.">Endothelial LSP1 is involved in endothelial dome formation, minimizing vascular permeability changes during neutrophil transmigration in vivo.</a> Blood. 117, 942-952 (2011).</li><li>Chavakis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+junctional+adhesion+molecule-C+promotes+neutrophil+transendothelial+migration+in+vitro+and+in+vivo.">The junctional adhesion molecule-C promotes neutrophil transendothelial migration in vitro and in vivo.</a> J. Biol. Chem. 279, 55602-55608 (2004).</li><li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Isolation+Protocol.">Neutrophil Isolation Protocol.</a> J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).</li><li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+leukocyte+transmigration:+cell+surface+interactions+and+signaling+events.">Regulation of leukocyte transmigration: cell surface interactions and signaling events.</a> J. Immunol. 172, 7-13 (2004).</li><li>Alcaide, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+recruitment+under+shear+flow:+it's+all+about+endothelial+cell+rings+and+gaps.">Neutrophil recruitment under shear flow: it's all about endothelial cell rings and gaps.</a> Microcirculation. 16, 43-57 (2009).</li><li>Jutila, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+neutrophil+adhesion+under+conditions+mimicking+blood+flow.">Measurement of neutrophil adhesion under conditions mimicking blood flow.</a> Neutrophil Methods and Protocols. 412, 239-256 (2007).</li><li>Cuvelier, S. L., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+leukocyte+rolling+and+adhesion+in+vitro+under+flow+conditions.">Studying leukocyte rolling and adhesion in vitro under flow conditions.</a> Basic Cell Culture Protocols. 290, 331-342 (2005).</li><li>Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Physiologic+E-Selectin-Mediated+Leukocyte+Rolling+on+Microvascular+Endothelium.">Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium.</a> J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).</li><li>Petzelbauer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+dermal+microvascular+endothelial+cell+antigen+expression+and+cytokine+responsiveness+in+situ+and+in+cell+culture.">Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture.</a> J. Immunol. 151, 5062-5072 (1993).</li><li>Bonder, C. S., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+leukocyte+recruitment+to+splanchnic+organs+to+reduce+inflammation.">Modulating leukocyte recruitment to splanchnic organs to reduce inflammation.</a> Am J Phys - Gastrointestinal and Liver Phys. 284, G729-G733 (2003).</li><li>Cuvelier, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eosinophil+adhesion+under+flow+conditions+activates+mechanosensitive+signaling+pathways+in+human+endothelial+cells.">Eosinophil adhesion under flow conditions activates mechanosensitive signaling pathways in human endothelial cells.</a> J. Exp. Med. 202, 865-876 (2005).</li><li>Massia, S. P., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+endothelial+cell+interactions+with+surface-coupled+adhesion+peptides+on+a+nonadhesive+glass+substrate+and+two+polymeric+biomaterials.">Human endothelial cell interactions with surface-coupled adhesion peptides on a nonadhesive glass substrate and two polymeric biomaterials.</a> J. Biomed. Mat. Res. 25, 223-242 (1991).</li></ol>

<html> Forskere har rutinemessig brukt endotelceller fra ulike vaskulære senger å studere nøytrofile rekruttering og sjelevandring. Eksempler omfatter, men er ikke begrenset til, dermale mikrovaskulære endotelceller 12, lever sinusformet endotelceller 13 og endotelceller fra menneskelig umbilical vein 10. Blant dem HUVEC oppnådd stor popularitet på grunn av sin relativt enkelt av isolasjon og tilgjengelighet. HUVEC er en mektig in vitro modell system som etterligner mange e...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens og Utstyr </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Collagenase Type 1 </td><td> Worthington </td><td> 4197 </td><td></td></tr><tr><td> Cord buffer </td><td></td><td></td><td> Sammensetning: 140 mm NaCl 4 mM KCl 10 mm D-glukose i 1mm NaH 2 PO 4 / Na 2 HPO 4 buffer ved pH 7,4 </td></tr><tr><td> Endotelcelle Media (ECM) </td><td></td><td></td><td> M199 med eagle salter supplert med 16% humant serum som inneholder 100 enheter av penicillin 100 mikrogram streptomycin og 0,3 mg L-glutamine/ml </td></tr><tr><td> M199 </td><td> GIBCO </td><td> 31100-035 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin Streptomycin Glutamat (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 10378-016 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Ibidi kamre </td><td> Ibidi </td><td> 80606 </td><td></td></tr><tr><td> TNF-α </td><td> Prepro Tech </td><td> 300-01A </td><td></td></tr><tr><td> Human albumin 20% løsning </td><td> Gemini Bioprodukter </td><td> 800120050 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS uten Ca 2 + og Mg 2 + </td><td> Sigma </td><td> H2487-10X </td><td></td></tr><tr><td> HBSS med Ca 2 + og Mg 2 + </td><td> Sigma </td><td> H1387-10X </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions

Nøytrofile er de mest tallrike type hvite blodlegemer. De danner en viktig del av det medfødte immunsystemet en. Under akutt betennelse, nøytrofile er de første betennelsesceller å migrere til området av skaden. Rekruttering av nøytrofile til en skade området er en trinnvis prosess som inkluderer første, utvidelse av blodkar for å øke blodgjennomstrømningen, andre, mikrovaskulære strukturelle endringer og rømme av plasmaproteiner fra blodet, for det tredje, rullende, heft og sjelevandring av nøytrofile over endotel, og fjerde akkumulering av nøytrofile på stedet av skader 2,3. Et bredt spekter av in vivo og in vitro metoder har utviklet seg slik at studiet av disse prosessene 4. Denne metoden fokuserer på nøytrofile sjelevandring tvers humane endotelceller. En populær metode for å undersøke de molekylære prosessene som er involvert i nøytrofile sjelevandring benytter menneskelige neutrophils samspill med primære humane umbilical vein endotelceller (HUVEC) 5. Nøytrofile isolasjon har blitt beskrevet visuelt sted 6, derfor denne artikkelen vil vise metode for isolering av HUVEC. Når isolert og vokst til samløpet, er endotelceller aktivert resulterer i oppregulering av adhesjon og aktivering molekyler. For eksempel, aktivering av endotelceller med cytokiner som TNF-alfa resulterer i økt E-selektin og IL-8 uttrykk 7. E-selektin medierer fangst og rulling av nøytrofile granulocytter og IL-8 medierer aktivisering og fast vedheft av nøytrofile. Etter vedheft nøytrofile transmigrate. Sjelevandring kan forekomme paracellularly (gjennom endotelcelle veikryss) eller transcellularly (via endotelceller selv). I de fleste tilfeller er disse interaksjonene oppstår under strømningsforhold funnet i blodkar 7,8. Parallellen plate flyt kammer er et mye brukt system som mimikrofoner den hydrodynamiske skjærspenninger funnet in vivo og muliggjør studiet av nøytrofile rekruttering henhold gjennomstrømning in vitro 9,10. Flere selskaper produserer parallelle plate flyt kamre og hver har sine fordeler og ulemper. Hvis fluorescerende bildebehandling er nødvendig, må glass eller en optisk lignende polymer som skal brukes. Endotelceller ikke vokse bra på glass. Her presenterer vi en enkel og rask metode for fase-kontrast, DIC og fluorescerende avbildning av nøytrofile sjelevandring med et lavt volum ibidi kanal lysbilde laget av en polymer som støtter den raske heft og vekst av humane endotelceller og har optiske kvaliteter som er sammenlignbare med glass. I denne metoden, ble endotelceller vokst og stimulert i en ibidi μslide. Nøytrofile ble introdusert under strømningsforhold og sjelevandring ble vurdert. Fluoriserende avbildning av avkjøringene aktivert sanntid fastsettelse av omfanget av paracellular versustranscellular sjelevandring.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions at JoVE.com

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Denne artikkelen beskriver først en prosedyre for å isolere humane endotelceller fra navle årer og deretter viser hvordan å bruke disse cellene til å undersøke nøytrofile sjelevandring henhold strømningsforhold. Ved å bruke en lav-volum flyt kammer laget av en polymer med de optiske egenskapene til glass, er live-celle fluorescerende avbildning av sjeldne celle populasjoner også mulig.

Isolering av menneskelige umbilical vein endotelceller og deres bruk i studiet av Neutrofil Sjelevandring Under strømningsforhold

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kvantitativ<em&gt; In vitro</em&gt; Analysen for å måle Neutrophil vedheft til Aktiverte primære humane mikrovaskulær endotelceller under statiske betingelser

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

En Flow Adhesion analysen til Study leucocyte Rekruttering til humane Sinus endotelet under forhold med Skjær Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Menneskelig Neutrophil Flow Chamber Adhesion analysen

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Real-time Imaging av endotelceller-celle Junctions Under Neutrophil Sjele under fysiologiske Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In vitro og in vivo modell for å studere bakteriell adhesjon til fartøyet veggen under strømningsforhold

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

Bruk av flowcytometrisystemer å vurdere tilstanden til Chromatin i T-celler

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Nøytrofile Isolering og analyse for å fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhet for Terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

Kvantifisering av Monocyte Transmigration og skum celle formasjon fra personer med kronisk opphissende vilkårene

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolasjon og In Vitro kultur Murine og menneskelig Alveolar makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

Samtidige studie av rekrutteringen av Monocyte subpopulasjoner Under flyt In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...