Name: a semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development
Uploaded: 2012-06-07T13:00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door NHI R01 subsidie ​​GM59690 toegekend aan KLV.

1. Eerste karakterisering en overwegingen <ol><li> Biofilmvorming wordt over het algemeen beïnvloed door celdichtheid en groeisnelheid. Daarom moet de groei (toename van de optische dichtheid (OD) tijd) en opbrengst (laatste cel nummer) van de stam (s) van belang bij het uitvoeren van eenvoudige groeicurve en cellen plating assays bepalen. Gebreken in de groei, of een gebrek aan correlatie tussen OD en mobiele nummer, moet rekening worden gehouden bij het interpreteren van de resultaten van het spotten van experimenten. </li><li> Inclusief de positieve en negatieve controles op dezelfde plaat bij de beoordeling van gerimpelde kolonievorming, als kleine plaat-to-plate variatie kan biofilm ontwikkeling beïnvloeden. </li><li> Identificeer de beste voorwaarden voor het spotten van, dat wil zeggen, degenen die de meest duidelijke verschillen tussen de controle en mutant (s) van belang zichtbaar te maken. Grow stammen in vloeibare cultuur onder verschillende omstandigheden, zoals verschillende media of temperaturen, en verschillende podiums van de groei (exponentiële of stationaire fase) voorafgaand aan het spotten. Spot 10 ul cultuur verschillende celdichtheden op de geschikte media, en incuberen bij de gewenste temperatuur tot kolonie morfologie gebleken. </li><li> Het eindpunt test impliceert beoordeling van gerimpelde kolonievorming op een vooraf bepaald tijdstip na het spotten (dat wil zeggen, 48 uur). Deze beoordeling is handig voor stammen die vertonen (of worden voorgesteld om te exposeren) ernstige defecten in biofilmvorming. </li><li> Het tijdsverloop test beoordeelt gerimpelde kolonievorming over een periode van tijd (dat wil zeggen, elk uur) na te spotten. Deze assay maakt een semi-kwantitatieve bepaling van biofilmvorming doordat de bepaling van de start van gerimpelde kolonievorming en het patroon ontwikkeling over een periode. De duur van het experiment en het aantal inzamelpunten voor een bepaalde tijd gevolgd, dient te worden vastgesteld in voorlopige experimenten. </li><li> Gemakkelijk te volgen is de tijd na het spotten, vastgesteld opdimeer op te tellen. </li></ol> 2. Microscopische beoordeling van Gerimpelde Kolonie morfologie in V. fischeri <ol><li> Inoculeer V. fischeri cellen in 5 ml LB-zout (LBS) medium 13 (1% [w / v] trypton, 0,5% [w / v] gistextract, 2% [w / v] natriumchloride, 50 mM Tris-HCl [ pH 7,5]) die de nodige antibiotica en incubeer onder schudden gedurende de nacht bij 28 ° C. In de ochtend, de cellen met een 1:100 verdunning subcultuur in 5 ml vers LBS medium en incubeer onder dezelfde voorwaarden tot de cellen hebben bereikt de gewenste OD 600 (bijv. OD 600 = 0,2 of 0,5). </li><li> Pipet 1 ml van de cultuur in een microfugebuis en centrifuge in een microcentrifuge bij maximale snelheid gedurende een minuut. Verwijder de bovenstaande vloeistof door aspiratie. Was de cellen resterende media en extracellulaire componenten verwijderen resuspenderen de pellet in 1 ml steriel 70% kunstmatig zeewater (ASW) (35 mM MgSO 4-7H 2 O 7 mM CaCb2-2H 2 O, 210 mM NaCl, 7 mM KCl) en het herhalen van de centrifugeren. Resuspendeer de gewassen pellet in 1 ml van 70% ASW. </li><li> Zorg ervoor dat elk monster hetzelfde aantal cellen, zoals geraamd door de OD bij 600 nm bevat. Maak de nodige aanpassingen door verdunning van meer geconcentreerde monsters met een extra 70% ASW. In inleidende experimenten, te herkennen culturen op verschillende eerste OD-waarden te bepalen van een optimale start OD voor een bepaalde set van stammen of voorwaarden. De beste resultaten worden verkregen V. fischeri wanneer spots worden gegenereerd uit culturen met een buitendiameter van ongeveer 0,2. </li><li> Spot 10 ul van de gewassen cellen op platen met LBS nodige antibiotica. Bij het spotten van een cultuur op een bord, zorg ervoor dat stabilisatie van de pipet (met uw vinger) net boven de agar oppervlak. Spot verticaal niet onder een hoek, en langzaam uitwerpen de vloeistof gelijkmatige verdeling van de vlek. Typisch elke stam een ​​keer gespot per plaat (tot 6 plaatsen per plaat), with meerdere platen (2-3) per experiment. </li><li> Om ervoor te zorgen dat de gevlekte cultuur blijft gelijkmatig verdeeld, zodat de plek om te drogen voordat het verplaatsen van de plaat naar de incubator. Keer de platen en incubeer ze op 28 ° C. </li><li> Bewaken van de morfologie van de groeiende spot per uur vanaf 12-15 uur na inenting. We maken gebruik van een dissectie scope (Zeiss STEMI 2000-C) met een camera bijlage (Progres C10 PLUS) en de Progres CapturePro en ImageJ software programma&#39;s om te observeren en te documenteren kolonie morfologie en de start en de progressie van gerimpelde kolonievorming te beoordelen. </li><li> Voor de specifieke setup in stap 2.5 komen de vlekken verlicht vanaf de onderkant door middel van een transparante glazen podium met een CL-1500 EG koud licht bron, terwijl de beelden worden opgenomen van boven. Deze opstelling is optimaal voor de beeldvorming gerimpelde kolonie ontwikkeling omdat V. fischeri kolonies (spots) zijn doorzichtig. </li><li> Aangezien de specifieke apparatuur in step 2,5, monitor gerimpelde kolonie morfologie van het gebruik van een stereomicroscoop die het mogelijk maakt voor de volledige kolonie weer te geven en heeft een verstelbare lichtbron en, idealiter, een aangesloten camera. Indien nodig kan een digitale camera worden gebruikt in afwezigheid van een aangesloten camera, maar dit is niet optimaal. </li><li> Om optimaal zichtbaar gerimpeld kolonie ontwikkeling is het noodzakelijk zowel de lichtintensiteit en hoek van terugkaatsing passen onder de bacteriële kolonies, dat de driedimensionale morfologie van de ontwikkeling biofilm kan worden waargenomen. De optimale belichting dat de sterkste contrast tussen de gevlekte kolonie en de omringende achtergrond agar, zodat de architectuur (rimpels) van de kolonie duidelijk onderscheiden voorzien. </li><li> In sommige gevallen dient de kleur van het gevlekte kolonie worden gehouden, zoals veranderingen in kleur kolonie tijdens biofilmvorming. Stel de intensiteit en de hoek van de lichtbron te onthullenDeze kleine veranderingen in kleur. Zodra de juiste instellingen worden bereikt, handhaven voor de duur van het experiment. </li><li> Merk hoeveel tijd vanaf het moment van inoculatie op het tijdstip waarop gerimpeld kolonievorming initieert per stam of aandoening. Definieer de start van gerimpelde kolonievorming het tijdstip waarop de vorming van patronen en 3D structuren (zoals strepen vormt aan de buitenrand of &quot;ribbels &#39;zich in het midden) eerst duidelijk. Mutant cellen vertonen verlaagd of verhoogd tijd aan het begin van gerimpelde kolonievorming (bijv. Fig. 2). </li><li> Documenteer de start en ontwikkeling van de gerimpelde kolonievorming door het vastleggen van geschikte digitale beelden. Het is belangrijk om dezelfde vergroting gebruiken bij het verzamelen beelden gedurende het experiment. Schakel het uitzicht vanaf het oculair van de microscoop op de computer scherm met behulp van de hendel aan de achterkant van de camera. Bij het schakelen tussen oculairen computerscherm bekijken, aanpassen van het uitzicht en zich dienovereenkomstig. </li><li> Voordat beeldvorming gevlekte culturen, wordt het deksel van de Petri plaat meestal verwijderd om het duidelijkste beeld te bieden. Dit is echter een optionele stap, zoals gevlekte culturen worden afgebeeld door het deksel met de installatie beschreven in stap 2.5 en 2.6. </li><li> Op elk tijdstip na de start van gerimpelde kolonievorming, let op het patroon van de gerimpelde kolonie ontwikkeling. De architectuur kan zich ontwikkelen van binnen naar buiten, of het buiten naar binnen Deze evaluatie biedt een mechanisme om de biofilms gevormd door verschillende stammen of onder verschillende omstandigheden te onderscheiden. </li><li> De diameter van de derde kolonie op elk tijdstip. Dit kan handmatig worden gedaan, of digitaal met behulp van een bijbehorende software programma. Als digitaal gedaan, gebruik maken van de Progres CapturePro software programma en de eerste de schaal bar afstemmen op de specifieke vergroting gebruikt in het experiment. Neem de schaal bar in gevangen elk beeld. </li><li> Om de kolonie diameter met behulp van de ImageJ softwareprogramma berekent, opent u elk beeld bestand. Standaardiseren van de schaalbalk als volgt: Selecteer de &quot;Rechte lijn optie&quot; op de werkbalk. Bedekken de geïntegreerde schaalbalk een rechte lijn van dezelfde lengte en breedte. Selecteer &quot;Set Scale&quot; van het tabblad &quot;te analyseren.&quot; In de &quot;bekende afstand&quot; vak, plaatst u de overeenkomstige lengte (bepaald door de oorspronkelijke schaal bar, dat wil zeggen, 2 mm) en selecteer &quot;OK&quot;. </li><li> Gebruik de &quot;rechte lijn&quot; optie om een ​​horizontale regel in te voegen over de plek. Onder het analyseren tab, selecteer &quot;maatregel&quot;. In de nieuwe resultaten venster zal de berekende lengte worden. Zorg voor een tweede meting door het invoegen van een loodrechte lijn over de plek. Herberekenen de diameter. Neem het gemiddelde van de twee metingen. De grafiek van de gemiddelde diameter van elke plek op elk tijdstip met behulp van een software programma, zoals Excel. </li><li> Het einde van het experiment wordt hetzij op een bepaald tijdstip of wanneer er geen verdereontwikkeling van de biofilm. Nadat het einde bereikt, consolideert de beelden in een cijfer (s) met het patroon ontwikkeling visualiseren tijd met een programma zoals Powerpoint. </li></ol> 3. Representatieve resultaten In deze experimenten gebruikt V. fischeri als een model organisme om biofilmvorming te bestuderen door het evalueren van de ontwikkeling van gerimpelde kolonies op een stevige agar oppervlak. Biofilm-producerende stammen van V. fischeri vorm kolonies met een uitgebreide 3D-architectuur binnen 40 uur (afb. 1) 8,9,14. Bij onderzoek gedurende een tijdsverloop, blijkt dat gerimpelde kolonievorming de controlestam initieert al ongeveer 12 uur na enting (afhankelijk van de specifieke omstandigheden) (Fig. 2) 9. Daarentegen wordt biofilmvorming door een vertegenwoordiger mutant vertraagd met ongeveer 4 uur, niet starten tot ongeveer 16 uur na de inoculatie 9. Repeats van deze experimenten suggereerde dat de timing relatief constant, waardoor de beoordeling semi-kwantitatieve 9. Een tweede semi-kwantitatieve maat biofilmvorming maakt gebruik van de verandering in diameter van de derde kolonie tijd. Zoals getoond in Fig. 3A, een vertegenwoordiger biofilm-bevoegde stam vormt kolonies die toenemen in complexiteit en de diameter ten opzichte van een representatieve stam die niet tot biofilms. Nauwkeurige metingen in de tijd van de diameters van de kolonies gevormd door de twee stammen gebleken dat de grootte van de biofilm-competent kolonies verhoogd op een grotere snelheid dan de biofilm negatieve kolonies en aan het einde tijdstip de twee verschillen van bijna 2 - vouw (Figuur 3B). Hoewel dus beelden van representatieve late tijd of &quot;eindpunt &#39;kolonie morfologie vaak in de literatuur kan extra semi-kwantitatieve gegevens worden verzameld die een beter begrip van de biofilm defect mogelijk.<img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig1.jpg" /> Figuur 1. Eindpunt assay. Deze figuur is een voorbeeld van een eindpunt assay met representatieve niet biofilm-vormende (links) en biofilm-vormende (rechts) stammen van V. fischeri. Deze beelden werden verzameld bij 40 uur na te spotten. Deze beelden werden gegenereerd met wild-type V. fischeri met een controle van vectoren (niet-biofilm-vormende) of een rscS tot overexpressie plasmide (biofilm-vormende) en maakten deel uit van de dataset verzameld voor Morris et al.., 2011. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig2.jpg" /> Figuur 2. Time-gangen-test. Het bovenste paneel bevat representatieve beelden van biofilmvorming door een biofilm-bevoegde controle-stam van V. fischeri over een geselecteerde tijd natuurlijk. Inleiding van biofilmvorming is duidelijk om 12 uur. Het onderste paneel bevat vertegenwoordiger images van een mutante stam van V. fischeri dat een vertraging (4 uur) in het begin van de gerimpelde kolonievorming loop van de tijd, met biofilmvorming initiëren op 16 uur na inoculatie vertoont. Merk op dat de 40 uren stammen lijken in de intensiteit en patronen van biofilmvorming, terwijl kleine verschillen tussen deze stammen alleen waargenomen bij de eerdere tijdstippen. Deze beelden zijn gegenereerd met rscS overexpressie wild-type en mutant sypE V. fischeri cellen en maakten deel uit van de dataset voor Morris et al.., 2011. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig3.jpg" /> Figuur 3. Colony diameter als semi-kwantitatieve analyse van biofilmvorming. (A) Tijd loop van biofilmvorming door een vertegenwoordiger van biofilm-vormende (bovenste panel) en niet-biofilm-vormende (onderste paneel) stammen van V. fischeri. Merk op dat de biofilm-vormende stam tot een sterkere stijging vertoontdiameter tijd ten opzichte van de biofilm niet vormende stam. Deze beelden werden gegenereerd met wild-type V. fischeri met daarin een rscS tot overexpressie plasmide (biofilm-vormende) of een controle van vectoren (niet-biofilm-vormende) en maakten deel uit van de dataset verzameld voor Morris et al.., 2011. (B) Een grafische weergave van de stijging van de kolonie diameter van de loop der tijd door de twee stammen in het paneel A. Deze gegevens zijn gegenereerd met behulp van de ImageJ-en Excel-software zoals beschreven in het protocol.

<ol>
	<li>Donlan, R. M., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+survival+mechanisms+of+clinically+relevant+microorganisms.">Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms.</a> Clin. Microbiol. Rev. 15, 167-167 (2002).</li><li>Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms+as+complex+differentiated+communities.">Biofilms as complex differentiated communities.</a> Annu. Rev. Microbiol. 56, 187 (2002).</li><li>Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+the+matrix+revisited.">Biofilms: the matrix revisited.</a> Trends Microbiol. 13, 20 (2005).</li><li>Branda, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fruiting+body+formation+by+Bacillus+subtilis.">Fruiting body formation by Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11621 (2001).</li><li>Beyhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+rugosity+and+biofilm+formation+in+Vibrio+cholerae:+comparison+of+VpsT+and+VpsR+regulons+and+epistasis+analysis+of+vpsT,+vpsR,+and+hapR.">Regulation of rugosity and biofilm formation in Vibrio cholerae: comparison of VpsT and VpsR regulons and epistasis analysis of vpsT, vpsR, and hapR.</a> J. Bacteriol. 189, 388 (2007).</li><li>Enos-Berlage, J. L., Guvener, Z. T., Keenan, C. E., McCarter, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+determinants+of+biofilm+development+of+opaque+and+translucent+Vibrio+parahaemolyticus.">Genetic determinants of biofilm development of opaque and translucent Vibrio parahaemolyticus.</a> Mol. Microbiol. 55, 1160 (2005).</li><li>Merritt, J. H., Brothers, K. M., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SadC+reciprocally+influences+biofilm+formation+and+swarming+motility+via+modulation+of+exopolysaccharide+production+and+flagellar+function.">SadC reciprocally influences biofilm formation and swarming motility via modulation of exopolysaccharide production and flagellar function.</a> J. Bacteriol. 189, 8154-8154 (2007).</li><li>Yip, E. S., Geszvain, K., DeLoney-Marino, C. R., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+symbiosis+regulator+rscS+controls+the+syp+gene+locus,+biofilm+formation+and+symbiotic+aggregation+by+Vibrio+fischeri.">The symbiosis regulator rscS controls the syp gene locus, biofilm formation and symbiotic aggregation by Vibrio fischeri.</a> Mol. Microbiol. 62, 1586-1586 (2006).</li><li>Morris, A. R., Darnell, C. L., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+a+novel+response+regulator+is+necessary+for+biofilm+formation+and+host+colonization+by+Vibrio+fischeri.">Inactivation of a novel response regulator is necessary for biofilm formation and host colonization by Vibrio fischeri.</a> Mol. Microbiol. 82, 114 (2011).</li><li>Nyholm, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+Vibrio+fischeri+and+nonsymbiotic+bacteria+in+the+dynamics+of+mucus+secretion+during+symbiont+colonization+of+the+Euprymna+scolopes+light+organ.">Roles of Vibrio fischeri and nonsymbiotic bacteria in the dynamics of mucus secretion during symbiont colonization of the Euprymna scolopes light organ.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 5113 (2002).</li><li>Yip, E. S., Grublesky, B. T., Hussa, E. A., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+conserved+cluster+of+genes+promotes+symbiotic+colonization+and+Ï&#x0192;54-dependent+biofilm+formation+by+Vibrio+fischeri.">A novel, conserved cluster of genes promotes symbiotic colonization and Ï&#x0192;54-dependent biofilm formation by Vibrio fischeri.</a> Mol. Microbiol. 57, 1485 (2005).</li><li>Mandel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+regulatory+gene+is+sufficient+to+alter+bacterial+host+range.">A single regulatory gene is sufficient to alter bacterial host range.</a> Nature. 458, 215 (2009).</li><li>Graf, J., Dunlap, P. V., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+transposon-induced+motility+mutations+on+colonization+of+the+host+light+organ+by+Vibrio+fischeri.">Effect of transposon-induced motility mutations on colonization of the host light organ by Vibrio fischeri.</a> J. Bacteriol. 176, 6986 (1994).</li><li>Geszvain, K., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hybrid+sensor+kinase+RscS+integrates+positive+and+negative+signals+to+modulate+biofilm+formation+in+Vibrio+fischeri.">The hybrid sensor kinase RscS integrates positive and negative signals to modulate biofilm formation in Vibrio fischeri.</a> J. Bacteriol. 190, 4437 (2008).</li><li>Krasteva, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+cholerae+VpsT+regulates+matrix+production+and+motility+by+directly+sensing+cyclic+di-GMP.">Vibrio cholerae VpsT regulates matrix production and motility by directly sensing cyclic di-GMP.</a> Science. 327, 866 (2010).</li><li>Romling, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+rdar+morphotype,+a+multicellular+behaviour+in+Enterobacteriaceae.">Characterization of the rdar morphotype, a multicellular behaviour in Enterobacteriaceae.</a> Cell Mol. Life. Sci. 62, 1234 (2005).</li><li>Berleman, J. E., Chumley, T., Cheung, P., Kirby, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rippling+is+a+predatory+behavior+in+Myxococcus+xanthus.">Rippling is a predatory behavior in Myxococcus xanthus.</a> J. Bacteriol. 188, 5888 (2006).</li><li>Lee, K., Veeranagouda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicrocells+form+by+reductive+division+in+macroscopic+Pseudomonas+aerial+structures.">Ultramicrocells form by reductive division in macroscopic Pseudomonas aerial structures.</a> Environ. Microbiol. 11, 1117 (2009).</li></ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

In dit werk beschrijven we een semi-kwantitatieve methode om te beoordelen biofilmvorming met behulp van V. fischeri als modelorganisme. In het bijzonder hebben we gebruik maken van een dissectie microscoop met camera gehechtheid aan biofilmvorming en ontwikkeling als gerimpelde kolonievorming loop van de tijd op een stevige ondergrond agar te controleren. In dit protocol, schetsen we twee specifieke types van methodes die we vaak gebruiken om gerimpelde kolonievorming te beoordelen. De eerste is de end-point test, die ons in staat stelt om de definitieve, totale 3D-architectuur, patronen, en de diameter van een gevlekte cultuur te observeren op een geselecteerde &quot;definitieve&quot; tijdstip. Deze aanpak is vooral nuttig voor de beoordeling van mutant stammen of omstandigheden die leiden tot dramatische defecten in biofilmvorming. Echter, deze aanpak geen onderscheid tussen meer subtiele verschillen die op het moment punten voor de geselecteerde eindpunt. Om meer te voet te volgen gerimpeld kolonievorming, gebruiken we een tijdsverloop test, die ons in staat stelt het identificeren van de start van de wrinkled kolonievorming en kijken naar de ontwikkeling in de tijd. Als gevolg van deze aanpak kan meer subtiele verschillen in timing van gerimpelde kolonievorming, 3D-architectuur en patronen worden geïdentificeerd. Wij hebben deze tijdsverloop assay twee semi-kwantitatieve bepalingen van biofilmvorming te genereren. Ten eerste kan het tijdstip waarop een spanning begint te ontwikkelen 3D architectuur worden vergeleken met die van controlestammen. Wij hebben gevonden dat de vertraging in biofilmvorming een bepaalde mutant onder dezelfde omstandigheden vrij consistent 9. Bijvoorbeeld in de gegevens in Fig. 2 mutant vertoonde steeds ongeveer 4 h vertraging bij de inleiding biofilmvorming. Een tweede semi-kwantitatieve maat biofilmvorming de verandering in de omvang van de diameter van de gerimpelde kolonie (spot). Wij hebben gevonden dat de diameter van gerimpelde kolonies geleidelijk verschilt van die van niet-biofilm kolonies tot ongeveer een 2-voudig verschil eind tijdstip (Fig. 3 </strong&gt;) (Morris en Visick, niet gepubliceerde gegevens). Tot op heden hebben we niet waargenomen een fenotype zonder de ander (dat wil zeggen, biofilmvorming zonder een toename van de kolonie diameter) (niet-gepubliceerde gegevens), ook al blijft het mogelijk een aantal mutanten zullen zich anders gedragen. Inderdaad is het gerapporteerd voor V. cholerae dat sommige gerimpelde kolonies resulteren in een aanzienlijke verhoging van de kolonie diameter en andere niet 15. Toch kon beoordeling van de verandering in diameter tijd te helpen bij de karakterisering van mutanten mogelijk biofilm en / of een extra kwantitatieve meting van mutanten met vertragingen in de ontwikkeling. Van beide maatregelen van biofilmvorming (tijd diameter) vaststellen van het begin van gerimpelde kolonievorming gevoeliger, maar ook subjectieve dan het bepalen van de diameter van de vlek. Maar toch, beide maatregelen zorgen voor een semi-kwantitatieve beoordeling van een fenotype dat is zeer nuttig om biofilm onderzoekers, maar niet gemakkelijk vatbaar is voor quantification. Bij het uitvoeren van gespot gekweekte testen, is het belangrijk om te overwegen de milieu-omstandigheden waarin de gevlekte stammen worden gekweekt. Gerimpelde kolonievorming wordt vaak beïnvloed door verschillende omgevingsfactoren, met inbegrip van de beschikbaarheid van voedingsstoffen, temperatuur en vochtigheid. Ter vermindering van de variabiliteit tussen de experimenten, is het nuttig om deze voorwaarden te standaardiseren zoveel mogelijk (dat wil zeggen het standaardiseren van de agar platen tot een bepaald maximum en het kweken van de gevlekte stammen bij een gecontroleerde temperatuur). Om verdere controle voor verschillen tussen het spotten van experimenten, is het belangrijk om de juiste controle stammen binnen elke reeks experimenten. Tenslotte het interpreteren van de gegevens van deze assays is nodig om een ​​experiment meerdere keren (3 +), voert het bijzonder bij de beoordeling kleine verschillen in gerimpeld kolonievorming (bijvoorbeeld een vertragingstijd in biofilmvorming of patronen verschillen). Enkele beperkingen van dit protocol zijn: 1) vaststelING of cellen een defect in de groei hebben kan lastig zijn: groei van cellen in vloeibare cultuur kan niet altijd volledig zijn groei op vaste media, en een nauwkeurige bepaling van de groei van biofilm-vormende cellen, die samen kunnen blijven plakken, is wellicht niet mogelijk; 2) stammen met groeistoornissen zal problematisch zijn om te analyseren, 3) het kan niet mogelijk zijn om met een diameter verschillen tussen de stammen met subtiele biofilm fenotypen onderscheiden; 4) voor de stammen die niet opgroeien in een concentrische ring het misschien niet mogelijk is om nauwkeurig te meten veranderingen in doorsnede; 5) terwijl de patronen waar te nemen tijdens de biofilmvorming, is er geen manier om de patronen van de daaruit voortvloeiende biofilm te kwantificeren, en 6) is er geen manier om de Z-dimensie van de biofilm te meten met deze experimentele set-up . Ondanks deze beperkingen wordt in dit protocol biedt toch een middel om numerieke gegevens te verkrijgen om te helpen bij de beoordeling van gerimpeld kolonievorming. In dit protocol maken we gebruik van een specifieke beeldvormingsysteem (dat wil zeggen, een Zeiss stereomicroscoop en Progres CapturePro imaging software) te observeren en te evalueren gerimpeld kolonievorming. Het afbeeldingsstelsel hier beschreven sterk: het vermogen tot het begin van gerimpelde kolonievorming te detecteren en derhalve evalueren ontwikkeling met een tijdsverloop benadering wordt aanzienlijk verbeterd door het gebruik van een stereomicroscoop. Indien deze technologie niet beschikbaar is, kan het protocol worden aangepast voor gebruik met andere apparatuur, zoals een eenvoudige digitale camera met een zoom focus. Hoewel dit protocol richt zich op de beoordeling van gerimpelde kolonie ontwikkeling, het kan ook worden aangepast om vlies vorming, een vorm van biofilm die ontstaat wanneer de cellen zijn statisch groeien in vloeibare cultuur te evalueren. Dit protocol kan ook nuttig zijn bij de beoordeling van andere indicatoren van biofilmvorming, inclusief het opnemen van specifieke kleurstoffen in de bonte koloniën tijdens de biofilm ontwikkeling. Deze omvatten, maar zijn niet beperkt tot, kleurstoffen, zoals Congo Red en calcofluof die kunnen binden aan cellulose, een gemeenschappelijk deel van bacteriële biofilms 16. Bovendien, dit protocol, hoewel ontworpen voor gebruik met V. fischeri is niet beperkt tot dit organisme, maar kan worden gegeneraliseerd tot studie biofilmvorming in vele verschillende organismen, zoals Bacillus subtilis 4 Vibrio cholerae 5 Vibrio parahaemolyticus 6 en Pseudomonas aeruginosa 7, die vertonen alle gerimpeld kolonievorming. Tenslotte kan ook worden aangepast aan andere kolonie morfologie een ontwikkelingspatroon, zoals mogelijk de patronen die optreedt tijdens de groei van Myxococcus Xanthus 17 en lucht structuurontwikkeling Pseudomonas aeruginosa 18 hebben bestuderen. Dit protocol is dus van algemeen nut voor de microbiologie en de biofilm onderzoekers.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de apparatuur </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Zeiss STEMI 2000-C dissectiemicroscoop </td><td> Zeiss </td><td> 45505300000000000 </td><td> (Verkregen door Lukas Microscoop) </td></tr><tr><td> Progres C10 PLUS </td><td> JENOPTIK Optical Systems GmbH </td><td> 017953-602-26 </td><td> Camera bijlage (verkregen door middel van Lukas Microscoop) </td></tr><tr><td> CL 1500 EG koudlichtbron </td><td> Zeiss </td><td> 4355400000000000 </td><td> (Verkregen door Lukas Microscoop) </td></tr><tr><td> Progres CapturePro </td><td> JENOPTIK Optical Systems GmbH </td><td> Gratis software met maatschappelijke camera </td><td> Computer programma voor het vastleggen van beelden </td></tr><tr><td> Afbeelding J </td><td> NIH </td><td> Gratis software van:ij / download.html &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html </td><td> Computerprogramma voor diameter metingen </td></tr></tbody></table>

a semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development

Biofilms, of oppervlakte-aangesloten gemeenten van de cellen ingekapseld in een extracellulaire matrix, vormen een gemeenschappelijke levensstijl voor veel bacteriën. Binnen een biofilm, bacteriële cellen vertonen vaak veranderd fysiologie, waaronder verbeterde resistentie tegen antibiotica en andere milieu-invloeden 1. Daarnaast kunnen biofilms spelen een belangrijke rol in de gastheer-microbe interacties. Biofilms ontstaan ​​wanneer bacteriën overgang van individuele, op planktonische cellen vormen complexe, multi-cellulaire gemeenschappen 2. In het laboratorium worden biofilms bestudeerd door de beoordeling van de ontwikkeling van specifieke biofilm fenotype. Een veel voorkomende biofilm fenotype omvat de vorming van gekreukt of geplooid bacteriële kolonies op vaste agar 3. Gerimpelde kolonievorming zorgt voor een bijzonder eenvoudige en nuttige manier te identificeren en karakteriseren van bacteriële stammen vertonen veranderde biofilm fenotypes, en milieu-omstandigheden die van invloed zijn biofilmvorming te onderzoeken. Wrinkled kolonievorming dient als een indicator van biofilmvorming in verschillende bacteriën, zowel Gram-positieve bacteriën, zoals Bacillus subtilis 4 en Gram-negatieve bacteriën, zoals Vibrio cholerae 5 Vibrio parahaemolyticus 6, Pseudomonas aeruginosa 7 en Vibrio fischeri 8. De mariene bacterie V. fischeri is uitgegroeid tot een model voor de biofilmvorming te wijten aan de cruciale rol van biofilms tijdens de gastheer kolonisatie: biofilms geproduceerd door V. fischeri ter bevordering van de kolonisatie van de Hawaiiaanse bobtail squid Euprymna scolopes 8-10. Belangrijk biofilm fenotypen in vitro correleren met het vermogen van V. fischeri cellen daadwerkelijk koloniseren gastdieren: stammen inbreuk biofilmvorming in vitro bezitten kolonisatie defect 9,11, terwijl stammen vertonen verhoogdebiofilm fenotypes zijn verbeterd voor kolonisatie 8,12. V. fischeri biedt daarom een eenvoudig model systeem om de mechanismen die bacteriën reguleren biofilmvorming en hoe biofilms invloed gastheer kolonisatie te beoordelen. In dit rapport beschrijven we een semi-kwantitatieve methode om te beoordelen biofilmvorming met behulp van V. fischeri als modelsysteem. Bij deze methode wordt de zorgvuldige spotten van bacteriële culturen op bepaalde concentraties en hoeveelheden op vaste agar media; een gevlekte cultuur is synoniem voor een enkele bacteriële kolonie. Deze &#39;gespot cultuur&#39; techniek kan worden gebruikt om de bruto biofilm fenotypes te vergelijken op een enkele, bepaalde tijd-punten (eindpunt assays), of op te sporen en subtiele biofilm fenotypes karakteriseren door de tijd-gangen-assays van biofilm ontwikkeling en metingen van de kolonie met een diameter , die wordt beïnvloed door biofilmvorming. Aldus deze techniek is een semi-kwantitatieve analyse van biofilmvorming perdoorzenden van de evaluatie van de timing en patroonvorming van de gerimpelde kolonie ontwikkeling en de relatieve omvang van de te ontwikkelen structuur, kenmerken die verder gaan dan de eenvoudige algemene morfologie.

Watch this Scientific Journal Video about A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development at JoVE.com

A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

Wij bieden een eenvoudig, semi-kwantitatieve methode om biofilm vorming te onderzoeken<em&gt; In vitro</em&gt;. Deze methode maakt gebruik van de Zeiss STEMI 2000-C stereomicroscoop (met camera bijlage) om zowel de timing en het patroon van biofilmvorming te volgen, zoals beoordeeld door de ontwikkeling van gerimpelde kolonies.

Een semi-kwantitatieve benadering van biofilmvorming Met behulp van Gerimpelde Colony ontwikkeling te beoordelen

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

Een Matrigel-Based Tube Formation Assay aan de vasculogene activiteit van tumorcellen beoordelen

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Omzetting van een Capture ELISA aan een Luminex xMAP test met behulp van een Multiplex Antilichaam screeningsmethode

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Mobiele Tracking Met behulp van Photoconvertible eiwitten tijdens ontwikkeling van de zebravis

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Blastomeer Explantaten om te testen voor mobiele Fate Commitment tijdens de embryonale ontwikkeling

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

Het beoordelen Soortspecifieke Bijdragen aan craniofaciale ontwikkeling met behulp van Quail-eend Chimeras

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

The Soft Agar Colony Formation Assay

De Soft Agar Kolonie Formatie Assay

Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

Gap Junctionele intercellulaire communicatie: Een functionele Biomarker om de negatieve gevolgen van de Giftige stoffen en toxines te beoordelen, en gezondheidsvoordelen van Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

A Simple Approach to Perform TEER Measurements Using a Self-Made Volt-Amperemeter with Programmable Output Frequency

Een eenvoudige benadering om TEER metingen uit te voeren met behulp van een zelfgemaakte volt-Amperemeter met programmeerbare uitgangsfrequentie

Transepithelial/endothelial electrical resistance (TEER) has been used since the 1980s to determine confluency and permeability of in vitro barrier model ...

Development of an Individual-Tree Basal Area Increment Model using a Linear Mixed-Effects Approach

Ontwikkeling van een individueel-boom basaal gebied increment model met behulp van een lineaire mixed-effects benadering

Here, we developed an individual-tree model of 5-year basal area increments based on a dataset including 21898 Picea asperata trees from 779 sample plots ...

A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior

Een pijpleiding die bilaterale in Utero-elektroporatie gebruikt om genetische invloeden op knaagdiergedrag te ondervragen

As genome-wide association studies shed light on the heterogeneous genetic underpinnings of many neurological diseases, the need to study the contribution ...