Name: a semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development
Uploaded: 2012-06-07T13:00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NHI R01 stipend GM59690 tildelt KLV.

1. Initial Karakterisering og hensyn <ol><li> Biofilmdannelse er generelt påvirket av celle tetthet og vekstrate. Derfor er det nødvendig å bestemme veksttakten (økning i optisk tetthet (OD) over tid) og yield (endelig celle nummer) av belastningen (e) av interesse ved å utføre enkle vekstkurve og celle plating analyser. Defekter i vekst, eller mangel på sammenheng mellom OD og celle nummer, må tas i betraktning når man tolker resultatene fra spotting eksperimenter. </li><li> Inkluder de aktuelle positive og negative kontroller på samme plate ved vurdering rynket koloni formasjon, som mindre plate-til-plate variasjon kan påvirke biofilm utvikling. </li><li> Identifiser de beste forholdene for spotting, dvs. de som avslører de mest distinkte forskjeller mellom kontroll og mutant (r) av interesse. Grow stammer i flytende kulturen under ulike forhold, for eksempel ulike medier eller temperaturer, og til annet stadiums av vekst (eksponensiell eller stasjonær fase) før spotting. Spot 10 mL av kultur på ulike celle tettheter inn på de aktuelle mediene, og inkuber ved ønsket temperatur til koloniens morfologi bli tydelig. </li><li> Den endepunkt analysen innebærer vurdering av rynkete koloni formasjon på et forhåndsbestemt tidspunkt etter spotting (dvs. 48 timer). Denne vurderingen er nyttig for stammer som stiller ut (eller er foreslått å stille ut) alvorlige mangler i biofilmdannelse. </li><li> Klokka Kurset analysen vurderer rynket koloni formasjon over en periode (dvs. hver time) etter småblødninger. Denne analysen gir en semi-kvantitativ vurdering av biofilmdannelse ved at fastsettelsen av starten av rynkete koloni formasjon og mønster utvikling over en periode. Varigheten av eksperimentet og antall innsamlingssteder for en gitt tid kurset skal fastsettes i gangsetting. </li><li> For enkelt å holde styr på tiden etter spotting, satt tilImer å telle opp. </li></ol> 2. Mikroskopisk Vurdering av rynkete Colony Morfologi i V. fischeri <ol><li> Inokuler V. fischeri celler i 5 ml LB-Salt (LBS) medium 13 (1% [w / v] tryptone, 0,5% [w / v] gjærekstrakt, 2% [w / v] natriumklorid, 50 mM Tris-HCl [ pH 7,5]) som inneholder alle nødvendige antibiotika og inkuber, med risting, overnatting på 28 ° C. I morgen, subkultur cellene med en 1:100 fortynning i 5 ml av frisk LBS medium og inkuberes under samme vilkår inntil cellene har nådd ønsket OD 600 (f.eks OD 600 = 0,2 eller 0,5). </li><li> Pipetter 1 ml av kulturen i et microfuge rør og sentrifuger i en microfuge sett med maksimal hastighet i ett minutt. Fjern supernatanten ved aspirasjon. Vask cellene til å fjerne rester av media og ekstracellulære komponenter ved resuspending pelleten i 1 ml sterile 70% kunstige sjøvann (ASW) (35 mM MgSO 4-7H 2 O, 7 mm CaCl2-2H 2 O, 210 mM NaCl, 7 mm KCl) og gjenta sentrifugering. Resuspender den vasket pellet i 1 ml 70% ASW. </li><li> Kontroller at hver prøven inneholder samme antall celler, som anslås av OD ved 600 nm. Foreta nødvendige justeringer ved å fortynne mer konsentrerte prøvene med ytterligere 70% ASW. I gangsetting, til spot-kulturer på ulike innledende OD verdier avgjøre en optimal start OD for et gitt sett av stammer eller vilkår. De beste resultatene oppnås for V. fischeri når plassene er generert fra kulturer med en OD på ca 0,2. </li><li> Spot 10 mL av de vaskede celler inn på LBS plater som inneholder alle nødvendige antibiotika. Når småblødninger en kultur på en plate, sørg for å stø pipetten (med fingeren) like over agaroverflaten. Spot vertikalt, ikke i en vinkel, og løse ut væsken langsomt for jevn fordeling av flekken. Vanligvis hver stamme er flekket gang per plate (inntil 6 flekker per plate), viddh flere plater (2-3) per eksperiment. </li><li> For å sikre at den flekkete kulturen fortsatt jevnt fordelt, la sted å tørke før du flytter plate til inkubatoren. Vend platene og inkuber dem ved 28 ° C. </li><li> Overvåk morfologi av den voksende flekken hourly begynnelsen på 12-15 timer etter inokulasjon. Vi bruker en dissekere omfang (Zeiss STEMI 2000-C) med et kamera vedlegg (Progres C10 PLUS) og Progres CapturePro og ImageJ programmer for å observere og dokumentere koloni morfologi og å vurdere start og progresjon av rynkete koloni formasjon. </li><li> For den spesifikke oppsett oppført i trinn 2.5, blir flekkene belyst fra undersiden gjennom et gjennomsiktig glass scene med en CL 1500 EC kald lyskilde, mens bildene blir tatt ovenfra. Dette oppsettet er optimalt for bildebehandling rynket koloni utvikling fordi V. fischeri kolonier (flekker) er gjennomsiktig. </li><li> I mangel av den spesifikke utstyret oppført i st2.5 EP, skjerm rynkete koloni morfologi bruke noen dissekere mikroskop som tillater full koloni visning og har en justerbar lyskilde og helst en vedlagt kamera. Om nødvendig kan et digitalt kamera også brukes i mangel av en vedlagt kamera, men dette er ikke optimal. </li><li> For å best visualisere rynket koloni utvikling, er det nødvendig å justere både lys intensitet og vinkel på refleksjon under den bakterielle koloniene slik at den tredimensjonale morfologi av utviklingslandene biofilm kan skjelnes. Bestem de optimale lysforhold som gir den sterkeste kontrasten mellom oppdaget kolonien og den omkringliggende agar bakgrunnen, slik at arkitekturen (rynker) av kolonien er klart synlig. </li><li> I noen tilfeller må fargen på flekket kolonien også tas i betraktning, som endringer i koloni farge kan forekomme i løpet av biofilmdannelse. Juster intensiteten og vinkelen på belysning kilde for å avdekkedisse subtile endringer i farge. Når de riktige innstillingene er oppnådd, vedlikeholde dem for varigheten av forsøket. </li><li> Merk hvor lang tid går fra tidspunktet for inokuleringen til den tiden hvor rynkete koloni formasjon starter for hver stamme eller tilstand. Definer starten av skrukkete koloni formasjon som tidspunktet hvor dannelsen av mønster og 3D strukturer (dvs. striasjoner forming i ytterkanten eller &quot;krusninger&quot; forekommer i midten) er første tydelig. Mutant celler kan ha redusert eller økt tid til starten av skrukkete koloni formasjonen (f.eks, fig. 2). </li><li> Dokumentere start og utvikling av rynket koloni formasjon ved å fange riktige digitale bilder. Det er viktig å bruke samme forstørrelse ved henting bilder gjennom hele forsøket. Bytt utsikten fra okularet av mikroskopet til dataskjermen ved hjelp av spaken på baksiden av kameraet. Når du bytter mellom okularetog dataskjermen visning, justere visningen og fokusere tilsvarende. </li><li> Før bildebehandling spotted kulturer, blir lokket til Petri plate vanligvis fjernet for å gi den klareste bildet. Men dette er et valgfritt trinn, som spottet kulturer kan avbildes gjennom lokket med oppsettet beskrevet i trinn 2.5 og 2.6. </li><li> På hvert tidspunkt etter starten av skrukkete koloni formasjon, merk mønster av skrukkete koloni utvikling. Arkitekturen kan utvikle seg fra innsiden og ut, eller utsiden i. Denne vurderingen gir en mekanisme for å skille de biofilm dannet av ulike stammer eller under ulike forhold. </li><li> Mål diameteren på å utvikle kolonien på hvert tidspunkt. Dette kan gjøres manuelt eller digitalt ved hjelp av en tilknyttet programmet. Hvis det gjøres digitalt, bruke Progres CapturePro programmet og første kalibrere skalaen bar til den spesifikke forstørrelse som brukes i forsøket. Inkluder skalaen bar i hvert bilde tatt. </li><li> For å beregne kolonien diameter med ImageJ programmet, åpne hver bildefil. Standardisere skalaen bar som følger: Velg &quot;Rett linje alternativet&quot; fra verktøylinjen. Overlappe innebygde skalaen bar med en rett linje av samme lengde og bredde. Velg &quot;Sett Scale&quot; fra fanen merket &quot;Analyze&quot;. I &quot;kjent distanse&quot; boksen, sette inn tilsvarende lengde (som bestemmes fra den opprinnelige skalaen bar, dvs. 2 mm) og velg &quot;OK&quot;. </li><li> Bruk &quot;Rett linje&quot; for å sette inn en horisontal linje på tvers av flekken. Under kategorien Analyser velg &quot;Mål&quot;. I den nye resultater vinduet, vil den beregnede lengde gis. Skaff en andre måling ved å sette inn en vinkelrett linje tvers over spot. Re-beregne diameter. Noter gjennomsnittet av de to målingene. Fremstille den gjennomsnittlige diameter for hver spot på hver gang punktet ved hjelp av et dataprogram som Excel. </li><li> Slutten av forsøket skjer enten ved en spesifisert tidspunkt, eller når det ikke lengerutvikling av biofilm. Når enden er nådd, konsolidere bildene inn i en figur (s) for å visualisere mønsteret utvikling over tid ved hjelp av et program som Powerpoint. </li></ol> 3. Representative Resultater I disse eksperimentene brukte vi V. fischeri som modell organisme for å studere biofilmdannelse ved å evaluere utviklingen av rynkete kolonier på en solid agaroverflaten. Biofilm-produserende stammer av V. fischeri danner kolonier med omfattende 3D ​​arkitektur innen 40 t (Fig. 1) 8,9,14. Når undersøkte over en tid selvfølgelig, blir det åpenbart at skrukkete koloni dannelsen av kontroll belastningen initierer så tidlig som ca 12 timer etter inokulasjon (avhengig av spesifikke forhold) (fig 2) 9. I kontrast er biofilmdannelse av en representant mutant forsinket med ca 4 t, ikke initiere til cirka 16 timer etter inokulasjon 9. Repeats av disse eksperimentene foreslo at timingen var relativt konsekvent, noe som gjør denne vurderingen semikvantitativ 9. En andre semi-kvantitativt mål for biofilmdannelse gjør bruk av endringen i diameter utvikle kolonien over tid. Som vist i fig. 3A, danner en representant biofilm-kompetent belastning kolonier som øker i kompleksitet og diameter i forhold til en representant stamme som ikke danner biofilm. Grundige målinger over tid for diameter koloniene dannet av disse to stammer viste at størrelsen på biofilm-kompetente kolonier steget en større hastighet enn de biofilm-negative kolonier, og på slutten tidspunkt de to varierte med nesten 2 - fold (Fig 3B). Derfor, selv om bilder av en representant sen tid eller &quot;end-point&quot; koloni morfologi ofte vises i litteraturen, kan ekstra, semi-kvantitative data samles som vil tillate en bedre forståelse av biofilm mangelen.<img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig1.jpg" /> Figur 1. Slutt-punkt analysen. Dette tallet er et eksempel på en ende-punkt analysen ved hjelp av representative ikke-biofilm-forming (venstre) og biofilm-forming (høyre) stammer av V. fischeri. Disse bildene ble tatt i 40 timer etter småblødninger. Disse bildene ble generert med vill-type V. fischeri inneholder en vektor kontroll (ikke-biofilm-forming) eller en rscS overekspresjon plasmid (biofilm-forming) og var en del av datasettet innsamlet for Morris et al., 2011. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig2.jpg" /> Figur 2. Time-kurs analysen. Den øvre panelet inneholder representative bilder av biofilmdannelse av en biofilm-sakkyndig kontroll stamme av V. fischeri over en valgt tid kurs. Oppstart av biofilmdannelse er tydelig på 12 timer. Den nedre panelet inneholder representant iMages av en mutert stamme av V. fischeri som viser en forsinkelse (4 h) i starten av skrukkete koloni formasjon over tid, med biofilmdannelse igangsetting på 16 timer etter vaksinasjon. Merk at på 40 timer stammer ligne på intensiteten og fordelingen av biofilmdannelse, mens små forskjeller mellom disse stammene er kun observert på tidligere tidspunkter. Disse bildene ble generert med rscS overekspresjon villtype og sypE mutant V. fischeri celler og var en del av datasettet innsamlet for Morris et al., 2011. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig3.jpg" /> Figur 3. Colony diameter som en semi-kvantitativ analyse av biofilmdannelse. (A) Tid løpet av biofilmdannelse ved representative biofilm-forming (øvre panel) og ikke-biofilm-forming (nedre panel) stammer av V. fischeri. Merk at biofilm-forming belastning viser en større økningi diameter over tid i forhold til ikke-biofilm forming belastning. Disse bildene ble generert med vill-type V. fischeri inneholder en rscS overekspresjon plasmid (biofilm-forming) eller en vektor kontroll (ikke-biofilm-forming) og var en del av datasettet innsamlet for Morris et al., 2011. (B) En grafisk representasjon av økningen i kolonien diameter over tid av de to stammene i panel A. Disse dataene ble generert ved hjelp av ImageJ og Excel programvare som beskrevet i protokollen.

<ol>
	<li>Donlan, R. M., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+survival+mechanisms+of+clinically+relevant+microorganisms.">Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms.</a> Clin. Microbiol. Rev. 15, 167-167 (2002).</li><li>Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms+as+complex+differentiated+communities.">Biofilms as complex differentiated communities.</a> Annu. Rev. Microbiol. 56, 187 (2002).</li><li>Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+the+matrix+revisited.">Biofilms: the matrix revisited.</a> Trends Microbiol. 13, 20 (2005).</li><li>Branda, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fruiting+body+formation+by+Bacillus+subtilis.">Fruiting body formation by Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11621 (2001).</li><li>Beyhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+rugosity+and+biofilm+formation+in+Vibrio+cholerae:+comparison+of+VpsT+and+VpsR+regulons+and+epistasis+analysis+of+vpsT,+vpsR,+and+hapR.">Regulation of rugosity and biofilm formation in Vibrio cholerae: comparison of VpsT and VpsR regulons and epistasis analysis of vpsT, vpsR, and hapR.</a> J. Bacteriol. 189, 388 (2007).</li><li>Enos-Berlage, J. L., Guvener, Z. T., Keenan, C. E., McCarter, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+determinants+of+biofilm+development+of+opaque+and+translucent+Vibrio+parahaemolyticus.">Genetic determinants of biofilm development of opaque and translucent Vibrio parahaemolyticus.</a> Mol. Microbiol. 55, 1160 (2005).</li><li>Merritt, J. H., Brothers, K. M., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SadC+reciprocally+influences+biofilm+formation+and+swarming+motility+via+modulation+of+exopolysaccharide+production+and+flagellar+function.">SadC reciprocally influences biofilm formation and swarming motility via modulation of exopolysaccharide production and flagellar function.</a> J. Bacteriol. 189, 8154-8154 (2007).</li><li>Yip, E. S., Geszvain, K., DeLoney-Marino, C. R., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+symbiosis+regulator+rscS+controls+the+syp+gene+locus,+biofilm+formation+and+symbiotic+aggregation+by+Vibrio+fischeri.">The symbiosis regulator rscS controls the syp gene locus, biofilm formation and symbiotic aggregation by Vibrio fischeri.</a> Mol. Microbiol. 62, 1586-1586 (2006).</li><li>Morris, A. R., Darnell, C. L., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+a+novel+response+regulator+is+necessary+for+biofilm+formation+and+host+colonization+by+Vibrio+fischeri.">Inactivation of a novel response regulator is necessary for biofilm formation and host colonization by Vibrio fischeri.</a> Mol. Microbiol. 82, 114 (2011).</li><li>Nyholm, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+Vibrio+fischeri+and+nonsymbiotic+bacteria+in+the+dynamics+of+mucus+secretion+during+symbiont+colonization+of+the+Euprymna+scolopes+light+organ.">Roles of Vibrio fischeri and nonsymbiotic bacteria in the dynamics of mucus secretion during symbiont colonization of the Euprymna scolopes light organ.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 5113 (2002).</li><li>Yip, E. S., Grublesky, B. T., Hussa, E. A., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+conserved+cluster+of+genes+promotes+symbiotic+colonization+and+Ï&#x0192;54-dependent+biofilm+formation+by+Vibrio+fischeri.">A novel, conserved cluster of genes promotes symbiotic colonization and Ï&#x0192;54-dependent biofilm formation by Vibrio fischeri.</a> Mol. Microbiol. 57, 1485 (2005).</li><li>Mandel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+regulatory+gene+is+sufficient+to+alter+bacterial+host+range.">A single regulatory gene is sufficient to alter bacterial host range.</a> Nature. 458, 215 (2009).</li><li>Graf, J., Dunlap, P. V., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+transposon-induced+motility+mutations+on+colonization+of+the+host+light+organ+by+Vibrio+fischeri.">Effect of transposon-induced motility mutations on colonization of the host light organ by Vibrio fischeri.</a> J. Bacteriol. 176, 6986 (1994).</li><li>Geszvain, K., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hybrid+sensor+kinase+RscS+integrates+positive+and+negative+signals+to+modulate+biofilm+formation+in+Vibrio+fischeri.">The hybrid sensor kinase RscS integrates positive and negative signals to modulate biofilm formation in Vibrio fischeri.</a> J. Bacteriol. 190, 4437 (2008).</li><li>Krasteva, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+cholerae+VpsT+regulates+matrix+production+and+motility+by+directly+sensing+cyclic+di-GMP.">Vibrio cholerae VpsT regulates matrix production and motility by directly sensing cyclic di-GMP.</a> Science. 327, 866 (2010).</li><li>Romling, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+rdar+morphotype,+a+multicellular+behaviour+in+Enterobacteriaceae.">Characterization of the rdar morphotype, a multicellular behaviour in Enterobacteriaceae.</a> Cell Mol. Life. Sci. 62, 1234 (2005).</li><li>Berleman, J. E., Chumley, T., Cheung, P., Kirby, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rippling+is+a+predatory+behavior+in+Myxococcus+xanthus.">Rippling is a predatory behavior in Myxococcus xanthus.</a> J. Bacteriol. 188, 5888 (2006).</li><li>Lee, K., Veeranagouda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicrocells+form+by+reductive+division+in+macroscopic+Pseudomonas+aerial+structures.">Ultramicrocells form by reductive division in macroscopic Pseudomonas aerial structures.</a> Environ. Microbiol. 11, 1117 (2009).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklært.

I dette arbeidet, beskriver vi en semi-kvantitativ metode for å vurdere biofilmdannelse hjelp V. fischeri som modell organisme. Spesielt benytter vi et dissekere mikroskop med kamera vedlegg til overvåke biofilmdannelse og utvikling som rynket koloni formasjon over tid på en solid agaroverflaten. I denne protokollen, skissere vi to bestemte typer metoder vi vanligvis bruker for å vurdere rynkete kolonien formasjon. Den første er endepunktet analysen, som tillater oss å observere den endelige, samlede 3D arkitektur, mønster, og diameteren på en flekkete kultur på en valgt &quot;endelig&quot; tidspunkt. Denne tilnærmingen er mest nyttig for å vurdere mutante stammer eller forhold som fører til dramatiske feil i biofilmdannelse. Men denne tilnærmingen ikke skille mellom flere subtile forskjeller som forekommer på tidspunkter før den valgte endepunktet. For nærmere overvåke rynket koloni dannelse, bruker vi en gang kurs analysen, som tillater oss å identifisere starten av wrinkled koloni dannelse og se dens utvikling over tid. Som et resultat av denne tilnærmingen, kan mer subtile forskjeller i timingen av rynkete koloni formasjon, 3D arkitektur, og mønster bli identifisert. Vi brukte denne gangen kurset analysen å generere to semi-kvantitative analyser av biofilmdannelse. Først kan det tidspunkt en påkjenning begynner å utvikle 3D-arkitektur bli sammenlignet med kontrollstammer. Vi har funnet at forsinkelsen i biofilmdannelse av en spesiell mutant under de samme forhold er ganske konsekvent ni. For eksempel, i de data som vises i fig. 2, mutant konsekvent viste om en 4 t forsinkelse i oppstart av biofilmdannelse. En andre semi-kvantitativt mål for biofilmdannelse er endringen i størrelsen på diameteren på skrukkete kolonien (spot). Vi har funnet at diameteren av rynkete kolonier gradvis skiller seg fra ikke-biofilm kolonier, nå om en to-fold forskjell i slutten tidspunkt (Fig. 3 </strong&gt;) (Morris og Visick, upubliserte data). Til dags dato har vi ikke observert en fenotype uten den andre (dvs. biofilmdannelse uten en økning i koloni diameter) (upubliserte data), selv om det fortsatt er mulig noen mutanter vil oppføre seg annerledes. Faktisk har det blitt rapportert for V. cholerae at noen rynket kolonier resultat i en betydelig økning i kolonien diameter, mens andre ikke gjør 15. Likevel kunne vurdere endringen i diameter over tid hjelpemiddel i karakterisering av potensielle biofilm mutanter og / eller gi en ekstra kvantitativt mål for mutanter med forsinkelser i utviklingen. Av de to målene på biofilmdannelse (tid og diameter), bestemme starten av skrukkete kolonien formasjon er mer følsom, men også mer subjektive, enn å bestemme diameteren på flekken. Likevel begge tiltakene gir en semi-kvantitativ vurdering av en fenotype som er svært nyttig å biofilm forskere, men ikke lett mottagelig for quantification. Når du utfører flekket kulturperler analyser, er det viktig å vurdere de miljømessige forholdene der flekket stammer dyrkes. Rynket koloni formasjonen er ofte påvirket av ulike miljøforhold, herunder næringsstoffer, temperatur og fuktighet. For å redusere variabilitet mellom eksperimenter, er det nyttig å standardisere disse forholdene så langt mulig (dvs. standardisere agar platene til et sett volum og dyrkning de flekkete stammene ved en kontrollert temperatur). For ytterligere kontroll for variasjon mellom spotting eksperimenter, er viktig å inkludere de aktuelle kontrollstammer innenfor hvert sett av eksperimenter. Til slutt, når man tolker data fra disse analysene, er det nødvendig å utføre ett eksperiment flere ganger (3 +), spesielt når vurderingen subtile forskjeller i rynket koloni formasjon (f.eks en forsinkelse i biofilmdannelse eller mønster forskjeller). Noen begrensninger i denne protokollen er: 1) fastsettelseing om cellene har en defekt i vekst kan være vanskelig: vekst av celler i flytende kultur kan ikke nøyaktig gjenspeile vekstrater på faste medier, og en nøyaktig bestemmelse av vekst av biofilm-forming celler, som kan holde sammen, kan ikke være mulig; 2) stammer med vekst defekter vil være problematisk å analysere, 3) kan det ikke være mulig å skille diameter forskjeller mellom stammer med subtile biofilm fenotyper, 4) for belastninger som ikke vokser i konsentriske ring kan det ikke være mulig å måle endringer i diameter, 5) mens mønster kan observeres under biofilmdannelse, er det ingen måte å kvantifisere fordelingen av den resulterende biofilm, og 6) er det ingen måte å måle Z-dimensjonen av biofilm med denne eksperimentelle oppsett . Til tross for disse begrensningene, gir denne protokollen likevel et middel for å få numeriske data til hjelp i vurderingen rynkete koloni formasjon. I denne protokollen, bruker vi en bestemt avbildningsystem (dvs. en Zeiss dissekere mikroskop og Progres CapturePro bildebehandlingsprogrammer) å observere og vurdere rynkete koloni formasjon. Det imaging system som beskrives her er mektig: evnen til å oppdage starten av skrukkete koloni dannelse, og dermed vurdere utvikling med en gang kurs tilnærming, er kraftig forbedret gjennom bruk av en dissekere mikroskop. Men hvis denne teknologien er tilgjengelig, kan protokollen tilpasses for bruk med annet utstyr, inkludert en enkel digital kamera med zoom fokus. Mens denne protokollen fokuserer på vurdering av rynkete koloni utvikling, kan det også bli modifisert for å vurdere pellicle formasjon, en form for biofilm som oppstår når cellene vokser statisk i flytende kultur. Denne protokollen kan også være nyttig i vurderingen av andre indikatorer på biofilmdannelse, herunder innarbeiding av konkrete fargestoffer inn i spotted koloniene under biofilm utvikling. Disse inkluderer, men er ikke begrenset til, fargestoffer som Kongo Rød og calcoflueller som kan binde seg til cellulose, en vanlig del av bakterielle biofilmer 16. I tillegg denne protokollen, men utviklet for bruk med V. fischeri, er ikke begrenset til denne organismen, men kan generaliseres til å studere biofilm dannes i en rekke forskjellige organismer, som for eksempel Bacillus subtilis 4, Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6, og Pseudomonas aeruginosa 7, som alle utstillingsområde rynkete koloni formasjon. Endelig det også kan tilpasses for å studere annen koloni morfologi som har en utviklingsmessig mønster, for eksempel, potensielt, mønsteret som oppstår under veksten av Myxococcus xanthus 17 og antenne struktur utvikling i Pseudomonas aeruginosa 18. Denne protokollen er derfor av generell nytte for mikrobiologi og biofilm forskere.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Navn på utstyr </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Zeiss STEMI 2000-C Dissecting Microscope </td><td> Zeiss </td><td> 45505300000000000 </td><td> (Innhentet gjennom Lukas Microscope) </td></tr><tr><td> Progres C10 PLUS </td><td> JENOPTIK Optical Systems GmbH </td><td> 017953-602-26 </td><td> Kamera vedlegg (fås gjennom Lukas Microscope) </td></tr><tr><td> CL 1500 EC Cold Light Source </td><td> Zeiss </td><td> 4355400000000000 </td><td> (Innhentet gjennom Lukas Microscope) </td></tr><tr><td> Progres CapturePro </td><td> JENOPTIK Optical Systems GmbH </td><td> Fri programvare med registrerte kamera </td><td> Dataprogram for bildefotografering </td></tr><tr><td> Bilde J </td><td> NIH </td><td> Fri programvare fra:IJ / download.html &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html </td><td> Dataprogram for diametermålinger </td></tr></tbody></table>

a semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development

Biofilm, eller overflate-vedlagte samfunn av celler innkapslet i en ekstracellulær matrix, representerer en felles livsstil for mange bakterier. Innenfor en biofilm, bakterieceller ofte har forandret fysiologi, inkludert forbedret resistens mot antibiotika og andre miljømessige påkjenninger 1. I tillegg kan biofilm spiller viktige roller i vert-mikrobe interaksjoner. Biofilm utvikle når bakterier overgangen fra individ, til planktoniske celler danne komplekse, flercellede samfunn 2. I laboratoriet blir biofilmer studert ved å vurdere utvikling av spesifikke biofilm fenotyper. En vanlig biofilm fenotype involverer dannelsen av rynkete eller rugose bakterie kolonier på fast agar medier tre. Rynket koloni formasjonen gir en spesielt enkel og nyttig måte å identifisere og karakterisere bakteriestammer stiller endrede biofilm fenotyper, og å undersøke miljøforhold som påvirker biofilmdannelse. Wrinkled koloni formasjon fungerer som en indikator på biofilmdannelse i en rekke bakterier, inkludert både Gram-positive bakterier, for eksempel Bacillus subtilis 4 og Gram-negative bakterier, for eksempel Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6, Pseudomonas aeruginosa 7, og Vibrio fischeri 8. Den marine bakterien V. fischeri har blitt en modell for biofilmdannelse på grunn av kritiske rollen av biofilm i løpet vert kolonisering: biofilm produsert av V. fischeri fremme sin kolonisering av Hawaii Bobtail squid Euprymna scolopes 8-10. Viktigere, biofilm fenotyper observert in vitro korrelerer med evne til V. fischeri celler effektivt kolonisere vertsdyr: stammer svekket biofilmdannelse in vitro har en kolonisering defekt 9,11, mens stammer stiller øktebiofilm fenotyper er forbedret for kolonisering 8,12. V. fischeri gir derfor en enkel modell system for å vurdere de mekanismer som bakteriene regulerer biofilmdannelse og hvordan biofilm innvirkning vert kolonisering. I denne rapporten beskriver vi en semi-kvantitativ metode for å vurdere biofilmdannelse hjelp V. fischeri som modell system. Denne metoden innebærer forsiktig småblødninger av bakteriekulturer i definerte konsentrasjoner og volumer inn på faste agar medier, en flekket kultur er synonymt med en enkelt bakteriell koloni. Denne &quot;spotted kultur&quot; teknikken kan benyttes til å sammenligne brutto biofilm fenotyper enkeltdoser, spesifisert tids-poeng (endepunkt analyser), eller for å identifisere og karakterisere subtile biofilm fenotyper gjennom tid-retters analyser av biofilm utvikling og målinger av kolonien diameter , som er påvirket av biofilmdannelse. Dermed gir denne teknikken en semi-kvantitativ analyse av biofilmdannelse, permitting evaluering av timing og fordelingen av rynket koloni utvikling og den relative størrelsen på å utvikle struktur, egenskaper som strekker seg utover den enkle generelle morfologi.

Watch this Scientific Journal Video about A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development at JoVE.com

A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

Vi tilbyr en enkel, semi-kvantitativ metode for å undersøke biofilmdannelse<em&gt; In vitro</em&gt;. Denne metoden tar nytte av Zeiss STEMI 2000-C Dissecting mikroskop (med kamera vedlegg) for å overvåke både timing og mønster av biofilmdannelse, som vurdert av utviklingen av rynkete kolonier.

En semi-kvantitativ tilnærming for å vurdere biofilmdannelse Bruke rynket Colony Development

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Konvertering av en Capture ELISA til en Luminex xMAP Assay bruker en Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Cell sporing ved hjelp av Photoconvertible Proteiner Under Sebrafisk Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Blastomere explants å teste for Cell Fate Commitment under embryonal utvikling

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

Vurdere artsspesifikke bidrag til Kraniofacial Development Bruke Quail-duck Chimeras

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

The Soft Agar Colony Formation Assay

Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

Gap junctional interkommunikasjons: En funksjonell biomarkør for å vurdere skadevirkninger av giftstoffer og giftstoffer, og helsemessige fordeler av Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

A Simple Approach to Perform TEER Measurements Using a Self-Made Volt-Amperemeter with Programmable Output Frequency

En enkel tilnærming til å utføre frivillig målinger ved hjelp av en selv laget volt-Amperemeter med programmerbar utgangsfrekvens

Transepithelial/endothelial electrical resistance (TEER) has been used since the 1980s to determine confluency and permeability of in vitro barrier model ...

Development of an Individual-Tree Basal Area Increment Model using a Linear Mixed-Effects Approach

Utvikling av en individuell tre basal område økning modell ved hjelp av en lineær mixed-effects tilnærming

Here, we developed an individual-tree model of 5-year basal area increments based on a dataset including 21898 Picea asperata trees from 779 sample plots ...

A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior

En rørledning ved hjelp av bilateral in utero elektroporasjon for å avhøre genetiske påvirkninger på gnageratferd

As genome-wide association studies shed light on the heterogeneous genetic underpinnings of many neurological diseases, the need to study the contribution ...