Name: a semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development
Uploaded: 2012-06-07T13:00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантом R01 NHI GM59690 присуждена KLV.

<ol>
	<li>Donlan, R. M., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+survival+mechanisms+of+clinically+relevant+microorganisms.">Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms.</a> Clin. Microbiol. Rev. 15, 167-167 (2002).</li><li>Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms+as+complex+differentiated+communities.">Biofilms as complex differentiated communities.</a> Annu. Rev. Microbiol. 56, 187 (2002).</li><li>Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+the+matrix+revisited.">Biofilms: the matrix revisited.</a> Trends Microbiol. 13, 20 (2005).</li><li>Branda, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fruiting+body+formation+by+Bacillus+subtilis.">Fruiting body formation by Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11621 (2001).</li><li>Beyhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+rugosity+and+biofilm+formation+in+Vibrio+cholerae:+comparison+of+VpsT+and+VpsR+regulons+and+epistasis+analysis+of+vpsT,+vpsR,+and+hapR.">Regulation of rugosity and biofilm formation in Vibrio cholerae: comparison of VpsT and VpsR regulons and epistasis analysis of vpsT, vpsR, and hapR.</a> J. Bacteriol. 189, 388 (2007).</li><li>Enos-Berlage, J. L., Guvener, Z. T., Keenan, C. E., McCarter, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+determinants+of+biofilm+development+of+opaque+and+translucent+Vibrio+parahaemolyticus.">Genetic determinants of biofilm development of opaque and translucent Vibrio parahaemolyticus.</a> Mol. Microbiol. 55, 1160 (2005).</li><li>Merritt, J. H., Brothers, K. M., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SadC+reciprocally+influences+biofilm+formation+and+swarming+motility+via+modulation+of+exopolysaccharide+production+and+flagellar+function.">SadC reciprocally influences biofilm formation and swarming motility via modulation of exopolysaccharide production and flagellar function.</a> J. Bacteriol. 189, 8154-8154 (2007).</li><li>Yip, E. S., Geszvain, K., DeLoney-Marino, C. R., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+symbiosis+regulator+rscS+controls+the+syp+gene+locus,+biofilm+formation+and+symbiotic+aggregation+by+Vibrio+fischeri.">The symbiosis regulator rscS controls the syp gene locus, biofilm formation and symbiotic aggregation by Vibrio fischeri.</a> Mol. Microbiol. 62, 1586-1586 (2006).</li><li>Morris, A. R., Darnell, C. L., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+a+novel+response+regulator+is+necessary+for+biofilm+formation+and+host+colonization+by+Vibrio+fischeri.">Inactivation of a novel response regulator is necessary for biofilm formation and host colonization by Vibrio fischeri.</a> Mol. Microbiol. 82, 114 (2011).</li><li>Nyholm, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+Vibrio+fischeri+and+nonsymbiotic+bacteria+in+the+dynamics+of+mucus+secretion+during+symbiont+colonization+of+the+Euprymna+scolopes+light+organ.">Roles of Vibrio fischeri and nonsymbiotic bacteria in the dynamics of mucus secretion during symbiont colonization of the Euprymna scolopes light organ.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 5113 (2002).</li><li>Yip, E. S., Grublesky, B. T., Hussa, E. A., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+conserved+cluster+of+genes+promotes+symbiotic+colonization+and+Ï&#x0192;54-dependent+biofilm+formation+by+Vibrio+fischeri.">A novel, conserved cluster of genes promotes symbiotic colonization and Ï&#x0192;54-dependent biofilm formation by Vibrio fischeri.</a> Mol. Microbiol. 57, 1485 (2005).</li><li>Mandel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+regulatory+gene+is+sufficient+to+alter+bacterial+host+range.">A single regulatory gene is sufficient to alter bacterial host range.</a> Nature. 458, 215 (2009).</li><li>Graf, J., Dunlap, P. V., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+transposon-induced+motility+mutations+on+colonization+of+the+host+light+organ+by+Vibrio+fischeri.">Effect of transposon-induced motility mutations on colonization of the host light organ by Vibrio fischeri.</a> J. Bacteriol. 176, 6986 (1994).</li><li>Geszvain, K., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hybrid+sensor+kinase+RscS+integrates+positive+and+negative+signals+to+modulate+biofilm+formation+in+Vibrio+fischeri.">The hybrid sensor kinase RscS integrates positive and negative signals to modulate biofilm formation in Vibrio fischeri.</a> J. Bacteriol. 190, 4437 (2008).</li><li>Krasteva, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+cholerae+VpsT+regulates+matrix+production+and+motility+by+directly+sensing+cyclic+di-GMP.">Vibrio cholerae VpsT regulates matrix production and motility by directly sensing cyclic di-GMP.</a> Science. 327, 866 (2010).</li><li>Romling, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+rdar+morphotype,+a+multicellular+behaviour+in+Enterobacteriaceae.">Characterization of the rdar morphotype, a multicellular behaviour in Enterobacteriaceae.</a> Cell Mol. Life. Sci. 62, 1234 (2005).</li><li>Berleman, J. E., Chumley, T., Cheung, P., Kirby, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rippling+is+a+predatory+behavior+in+Myxococcus+xanthus.">Rippling is a predatory behavior in Myxococcus xanthus.</a> J. Bacteriol. 188, 5888 (2006).</li><li>Lee, K., Veeranagouda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicrocells+form+by+reductive+division+in+macroscopic+Pseudomonas+aerial+structures.">Ultramicrocells form by reductive division in macroscopic Pseudomonas aerial structures.</a> Environ. Microbiol. 11, 1117 (2009).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

В этой работе мы описываем полуколичественного метода оценки биопленки использованием V. fischeri в качестве модельного организма. В частности, мы используем рассечения микроскоп с камерой крепление для контроля формирования биопленок и развития, морщинистой формирования колонии в течение долгого времени на твердой поверхности агара. В этом протоколе, мы выделяем два конкретных типов методов, которые мы обычно используем для оценки морщинистое образование колонии. Первым из них является конечной точкой анализа, который позволяет наблюдать в финал, общий 3D архитектуру, рисунка, и диаметр культуры пятнистый на выбранный «окончательные» момент времени. Такой подход является наиболее полезным для оценки мутантных штаммов или условия, которые приводят к резкому дефектами в формирование биопленок. Однако такой подход не делает различия между более тонкие различия, происходящие в моменты времени до выбранной конечной точки. Для более внимательно следить за морщинистой формирование колоний, мы используем анализ времени, конечно, что позволяет определить начало шrinkled образование колоний и следить за ее развитием с течением времени. В результате такого подхода, более тонкие различия в сроках морщинистое образование колонии, 3D архитектуру, и структурирование может быть идентифицирован. Мы использовали этот анализ раз курс для создания двух полуколичественного анализов формирование биопленок. Во-первых, время, когда напряжение начинает развиваться 3D-архитектура может быть по сравнению с контролем напряжения. Мы нашли, что задержка с формированием биопленки конкретного мутанта на тех же условиях достаточно последовательно 9. Например, в данные, приведенные на рис. 2 мутанта постоянно выставляются около 4 часов задержки начала формирование биопленок. Второй полуфинал количественная мера биопленки является изменение размера диаметра морщинистые колонии (спот). Мы обнаружили, что диаметр морщинистые колонии постепенно отличается от не-биопленки колонии, достигнув 2-кратную разницу в точке время окончания (рис. 3 </сильный&gt;) (Morris и Visick, неопубликованные данные). На сегодняшний день мы не наблюдал один фенотип без другого (например, образование биопленки без увеличения диаметра колонии) (неопубликованные данные), хотя и остается возможной некоторые мутанты будут вести себя по-разному. Действительно, было сообщено, для В. холерных, что некоторые морщинистой результате колоний в значительном увеличении в колонии диаметром в то время как другие этого не делают 15. Тем не менее, оценивая изменения в диаметре, с течением времени может помочь в характеристике потенциальных мутантов биопленки и / или предоставить дополнительную количественную меру мутантов с задержками в развитии. Из этих двух мер биопленки (время и диаметр), определения начала морщинистое образование колоний является более чувствительным, но и более субъективным, чем определения диаметра пятна. Тем не менее, обе эти меры обеспечивают полу-количественной оценки фенотипа, что является чрезвычайно полезным для исследователей биопленки, но не легко поддаются quantificatioл. При выполнении заметил культурный анализов, важно принять во внимание экологические условия, в которых замечены штаммов культивируют. Морщинистой формирование колоний, часто под влиянием различных условий окружающей среды, в том числе наличие питательных веществ, температура и влажность. Для уменьшения изменчивости между экспериментами, это полезно для стандартизации этих условий, как много можно (т.е. стандартизации агаром в заданном объеме и культивирования штаммов замечены при контролируемой температуре). Для дальнейшего контроля за изменчивостью между пятен экспериментов, важно включить соответствующие штаммы контроля в каждой серии экспериментов. Наконец, при интерпретации данных этих исследований, необходимо выполнить любой эксперимент несколько раз (3 +), особенно при оценке тонкие различия в морщинистое образование колоний (например, задержка в формировании биопленок или рисунок, различия). Некоторые ограничения этого протокола являются: 1) определяющиеING ли клетки имеют дефект роста может быть трудно: рост клеток в культуральной жидкости могут не точно отражать темпы роста на твердых средах, а также точного определения роста биопленки формирования клеток, которые могут держаться вместе, не всегда возможно; 2) деформации с ростом дефектов будет проблематично для анализа, 3) он не может быть можно выделить диаметр различия между штаммами с тонкими фенотипов биопленки, 4) для штаммов, которые не растут в концентрические кольца, не всегда возможно точно измерить изменения в диаметре, 5), а паттерны можно наблюдать во время формирование биопленок, нет никакого способа для количественного определения паттерна в результате биопленки и 6) нет способа измерить Z-размерности биопленки с этой экспериментальной установки . Несмотря на эти ограничения, тем не менее, этот протокол предоставляет возможность получить численные данные, чтобы помочь в оценке морщинистое образование колонии. В этом протоколе, мы используем специальный изображенийсистемы (например, Zeiss рассечения микроскопа и Progres CapturePro изображений программное обеспечение), чтобы наблюдать и оценивать морщинистое образование колонии. Системы визуализации, описанные здесь является мощным: способность обнаруживать начало морщинистое образование колонии, и таким образом оценивать развитие с подхода, конечно время значительно усиливается с помощью рассечения микроскопом. Однако, если эта технология отсутствует, протокол может быть адаптирован для использования с другим оборудованием, в том числе простой цифровой фотоаппарат с зум-фокус. Хотя этот протокол сосредоточен на оценке морщинистой развитие колонии, она также может быть изменен, чтобы оценить пленка образование, форма биопленки, которая развивается, когда клетки растут статически в культуральной жидкости. Этот протокол также может оказаться полезной при оценке других показателей формирование биопленок, в том числе включение конкретных красителей в колонии пятнистых процессе развития биопленки. Они включают, но не ограничиваются, красители, такие как Конго красный и calcofluили которые могут связываться с целлюлозой, общие компоненты бактериальных биопленок 16. Кроме того, этот протокол, хотя и разработана для использования совместно с В. fischeri, не ограничивается этим организмом, но может быть обобщен на изучение биопленки во многих различных организмов, таких как Сенная палочка 4, холерный вибрион 5, Vibrio parahaemolyticus 6 и синегнойной палочки 7, все выставки морщинистое образование колонии. Наконец, он также может быть адаптирована для изучения морфологии других колоний, которые имеют с развитием картины, такие, как, возможно, паттерн, который происходит в процессе роста Myxococcus Ксанф 17 и воздушный развитие структуры синегнойной палочки 18. Этот протокол, таким образом, общего пользования в области микробиологии и биопленки исследователей.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Наименование оборудования </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> Zeiss Stemi 2000-C Анатомический микроскоп </td><td> Zeiss </td><td> 45505300000000000 </td><td> (Полученные через микроскоп Лукас) </td></tr><tr><td> Прогресс C10 PLUS </td><td> JENOPTIK Optical Systems GmbH </td><td> 017953-602-26 </td><td> Камера вложений (полученные через микроскоп Лукас) </td></tr><tr><td> CL 1500 EC источник холодного света </td><td> Zeiss </td><td> 4355400000000000 </td><td> (Полученные через микроскоп Лукас) </td></tr><tr><td> Прогресс CapturePro </td><td> JENOPTIK Optical Systems GmbH </td><td> Свободное программное обеспечение с зарегистрированным камерой </td><td> Компьютерная программа для захвата изображения </td></tr><tr><td> Изображение J </td><td> NIH </td><td> Бесплатное программное обеспечение:И.Я. / download.html &quot;целевых =&quot; _blank &quot;&gt; http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html </td><td> Компьютерная программа для измерения диаметра </td></tr></tbody></table>

a semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a biofilm, bacterial cells often exhibit altered physiology, including enhanced resistance to antibiotics and other environmental stresses 1. Additionally, biofilms can play important roles in host-microbe interactions. Biofilms develop when bacteria transition from individual, planktonic cells to form complex, multi-cellular communities 2. In the laboratory, biofilms are studied by assessing the development of specific biofilm phenotypes. A common biofilm phenotype involves the formation of wrinkled or rugose bacterial colonies on solid agar media 3. Wrinkled colony formation provides a particularly simple and useful means to identify and characterize bacterial strains exhibiting altered biofilm phenotypes, and to investigate environmental conditions that impact biofilm formation. Wrinkled colony formation serves as an indicator of biofilm formation in a variety of bacteria, including both Gram-positive bacteria, such as Bacillus subtilis 4, and Gram-negative bacteria, such as Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6, Pseudomonas aeruginosa 7, and Vibrio fischeri 8.
The marine bacterium V. fischeri has become a model for biofilm formation due to the critical role of biofilms during host colonization: biofilms produced by V. fischeri promote its colonization of the Hawaiian bobtail squid Euprymna scolopes 8-10. Importantly, biofilm phenotypes observed in vitro correlate with the ability of V. fischeri cells to effectively colonize host animals: strains impaired for biofilm formation in vitro possess a colonization defect 9,11, while strains exhibiting increased biofilm phenotypes are enhanced for colonization 8,12. V. fischeri therefore provides a simple model system to assess the mechanisms by which bacteria regulate biofilm formation and how biofilms impact host colonization.
In this report, we describe a semi-quantitative method to assess biofilm formation using V. fischeri as a model system. This method involves the careful spotting of bacterial cultures at defined concentrations and volumes onto solid agar media; a spotted culture is synonymous to a single bacterial colony. This 'spotted culture' technique can be utilized to compare gross biofilm phenotypes at single, specified time-points (end-point assays), or to identify and characterize subtle biofilm phenotypes through time-course assays of biofilm development and measurements of the colony diameter, which is influenced by biofilm formation. Thus, this technique provides a semi-quantitative analysis of biofilm formation, permitting evaluation of the timing and patterning of wrinkled colony development and the relative size of the developing structure, characteristics that extend beyond the simple overall morphology.

Watch this Scientific Journal Video about A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development at JoVE.com

A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

Мы предлагаем простые, полу-количественный метод для исследования биопленки<em&gt; В пробирке</em&gt;. Этот метод использует Zeiss Stemi 2000-C Анатомический микроскоп (с камерой приложение) для мониторинга сроков и структуры биопленки, по оценке развития морщинистые колонии.

Полу-количественный подход к оценке биопленки использование морщинистой развития колонии

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

Матригель основе труб Формирование Пробирной для оценки Vasculogenic активность опухоли

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Преобразование Capture ИФА в Пробирной Luminex Xmap помощью скрининга Мультиплекс антител методом

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Сотовые слежения Использование Photoconvertible белков в процессе развития данио рерио

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Бластомеров эксплантов для тестирования для сотовых приверженности судьбы во время эмбрионального развития

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

Оценка Виды-конкретный вклад в черепно-лицевой развития Использование Перепела-утки химер

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

The Soft Agar Colony Formation Assay

Формирование Анализ Soft Агар колонии

Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

Gap Junctional межклеточной коммуникации: Функциональная биомаркеров для оценки неблагоприятного воздействия токсикантов и токсинами, и Польза для здоровья натуральных продуктов

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

A Simple Approach to Perform TEER Measurements Using a Self-Made Volt-Amperemeter with Programmable Output Frequency

Простой подход к выполнению измерений TEER с использованием самодельного Вольт-Ампереметра с программируемой частотой вывода

Transepithelial/endothelial electrical resistance (TEER) has been used since the 1980s to determine confluency and permeability of in vitro barrier model ...

Development of an Individual-Tree Basal Area Increment Model using a Linear Mixed-Effects Approach

Разработка индивидуально-дерево Базальной модели прироста области с использованием линейного подхода смешанных эффектов

Here, we developed an individual-tree model of 5-year basal area increments based on a dataset including 21898 Picea asperata trees from 779 sample plots ...

A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior

Трубопровод с использованием двустороннего в утробе матери электропорации для допроса генетического влияния на поведение грызунов

As genome-wide association studies shed light on the heterogeneous genetic underpinnings of many neurological diseases, the need to study the contribution ...