Name: a semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development
Uploaded: 2012-06-07T13:00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development at JoVE.com

Bu çalışma NHI R01 hibe KLV verilen GM59690 tarafından desteklenmiştir.

1. İlk Karakterizasyonu ve Düşünceler <ol><li> Biyofilm oluşumu genellikle hücre yoğunluğu ve büyüme hızı etkilenir. Bu nedenle, büyüme oranı (zamanla optik yoğunluk (OD) artış) ve basit bir büyüme eğrisi ve hücre kaplama deneyler gerçekleştirilerek ilgi suşu (ler) in verimi (nihai hücre sayısı) belirlenmesi gereklidir. Deneyler lekelenme sonuçları yorumlanırken büyüme, veya OD ve hücre sayısı arasında korelasyon eksikliği hataları dikkate alınmalıdır. </li><li> Küçük plaka-to-plaka değişimi biyofilm gelişimi etkileyebilecek gibi, buruşuk koloni oluşumu değerlendirirken aynı plaka üzerinde uygun pozitif ve negatif kontrolleri ekleyin. </li><li> Tespit için en iyi koşulları, yani kontrol ve ilgi mutant (lar) arasındaki en belirgin farklılıklar ortaya olanları belirleyin. Gibi farklı medya ya da sıcaklık gibi çeşitli koşullar altında sıvı kültür suşları büyümek ve farklı sahneönce lekelenme büyüme (üstel veya sabit faz) s. Nokta 10 uygun ortam üzerine çeşitli hücre yoğunluklarında kültür ul ve koloni morfolojileri belirgin hale gelene kadar istenilen sıcaklıkta inkübe edin. </li><li> Son nokta testi (yani 48 saat) tespit sonra önceden belirlenmiş bir zaman noktasında kırışmış koloni gelişimi değerlendirmeyi içerir. Bu değerlendirme suşlar için yararlıdır biyofilm sergileniyor (ya da sergilemek için önerilmektedir) ciddi kusurlar. </li><li> Zaman elbette testi bir süre (yani, her saat) sonrası lekelenme üzerinde kırışmış koloni oluşumu değerlendirir. Bu testte bir süre boyunca buruşuk koloni oluşumu ve kalıp gelişme başlangıç ​​belirlenmesi izin vererek biyofilm bir yarı-niceliksel izin verir. Belirli bir zaman ders için toplama noktaları deney ve sayısı süresi ön deneylerde tespit edilmelidir. </li><li> Kolayca ayarlanır, sonrası lekelenme zaman izlemek içinkadar saymak için imer. </li></ol> 2. V. yılında Buruşuk Koloni Morfolojisi Mikroskopik Değerlendirme fischeri <ol><li> Inoküle V. LB-Tuz (LBS) orta 13 (1% [w / v] tripton,% 0.5 [w / v] maya ekstresi,% 2 [w / v] sodyum klorid, 50 mM Tris-HCl [5 ml içine fischeri hücreleri pH 7.5]) 28 gece, titreme ile gerekli antibiyotik ve inkübe içeren ° C Hücreleri istenilen OD 600 ulaşana kadar Sabah, aynı koşullar altında taze LBS orta ve inkübe 5 ml içine bir 1:100 ile hücreleri altkültürü (örneğin, OD 600 = 0.2 veya 0.5). </li><li> Bir mikrofüj tüpü ve bir dakika maksimum hızda bir mikrofüj setindeki santrifüj içinde kültür pipetle 1 ml. Aspirasyon ile süpernatantı. Steril% 70 yapay deniz suyu 1 ml (ASW) (35 mM MgSO 4-7H 2 O, 7 mM CaCl yılında pelet resuspending tarafından artık medya ve ekstrasellüler bileşenleri kaldırmak için hücreleri yıkayın2-2H 2 O, 210 mM NaCl, 7 mM KCl) ve santrifüjleme tekrarlayarak. % 70 ASW 1 ml yıkanmış pelletini. </li><li> Her örnek olarak 600 nm&#39;de OD tarafından tahmin hücrelerin, aynı sayıda içerdiğinden emin olun. Ek% 70 ASW ile daha konsantre örnekleri seyreltilmesiyle Gerekli ayarlamaları yapın. Ön deneylerde, çeşitli başlangıç ​​OD değerlerini azından nokta kültürler suşları veya koşullarının, belirli bir küme için en uygun başlangıç ​​OD belirlenmesi. En iyi sonuçlar elde edilmiştir V. noktalar yaklaşık 0.2 bir OD ile kültürler üretilir fischeri. </li><li> Gerekli antibiyotik içeren LBS plakaları üzerine yıkanmış hücrelerin 10 ul nokta. Bir tabağa bir kültür lekelenme olduğunda, sadece agar yüzeyinden sabit pipet (parmağınızla) emin olun. Olmayan bir açı, dikey nokta ve spot tekdüze dağılım için yavaş yavaş sıvı çıkarır. Genellikle her bir suş (plaka başına kadar 6 lekeler) plaka başına bir kez fark edilir, espriDeneme başına h birden plakaları (2-3). </li><li> Benekli kültür eşit dağıtılmış kalmasını sağlamak için, nokta inkübatöre plaka geçmeden önce kurumasını bekleyin. Plakalar ters çevirin ve 28 de bunları tasarlamak ° C </li><li> Aşılanmasını takiben 12-15 saat büyüyen nokta saatlik başından morfolojisi izleyin. Biz bir kamera eki (Progres C10 PLUS) ve Progres CapturePro ve gözlemlemek ve belgelemek koloni morfolojisi ve kırışmış koloni oluşumunun başlangıcında ve ilerleyişini değerlendirmek üzere ImageJ yazılım programları ile bir diseksiyon kapsamı (Zeiss STEMI 2000-C) kullanın. </li><li> Görüntü yukarıdan yakalanır ise adım 2.5 listelenen özel kurulum için, lekeler, bir CL 1500 EC soğuk ışık kaynağı ile şeffaf bir cam aşamasında altından aydınlatılmıştır. Bu kurulum görüntüleme kırışmış koloni gelişimi için, çünkü V. uygunudur fischeri koloniler (noktalar) saydam vardır. </li><li> St listelenen spesifik ekipman yokluğundaep 2.5, tam koloni izlenmesine olanak verir ve ayarlanabilir ışık kaynağı ve ideal olarak, ekli bir kamera olan herhangi bir mikroskop kullanarak monitör buruşuk koloni morfolojisi. Eğer gerekirse, bir dijital kamera da ekli bir kameranın yokluğunda kullanılmıştır, ancak bu optimal değildir edilebilir. </li><li> En buruşuk koloni gelişimi görselleştirme, bunun geliştirilmesi biyofilmlerin üç boyutlu şekil ayırt edilebilir olduğu gibi bakteriyel koloniler altında ışık yansıma yoğunluğu açısı ve hem de ayarlamak için gereklidir. Benekli koloni ve koloni mimarisi (kırışıklık) açıkça ayırt olduğu gibi çevreleyen agar arkaplan arasında güçlü kontrast sağlamak optimum aydınlatma koşulları belirler. </li><li> Koloni renk değişiklikleri biyofilm oluşumu sırasında oluşabilir gibi bazı durumlarda, benekli koloni rengi de dikkate alınmalıdır. Ortaya çıkarmak için ışık kaynağının şiddeti ve açısını ayarlayınrenklenmesi bu ince değişiklikler. Uygun ayarları elde edilir sonra, deneme süresi boyunca onları korumak. </li><li> Ne kadar süre geçtiğini inokülasyon zaman buruşmuş koloni gelişimi her tür ya da durum için başlatır hangi zaman unutmayın. Modelleme ve 3B yapıların formasyonu (yani, çizgiler oluşturan dış kenarında veya &#39;dalgaların&#39; merkezi meydana gelen) ilk açıktır hangi bir zaman noktası olarak buruşuk koloni oluşumunun başlangıç ​​tanımlayabilir. Mutant hücreler koloni buruşuk oluşumunun başlangıç ​​(örn., Şek. 2) için zaman azaldığı ya da artan rastlamak mümkündür. </li><li> Uygun dijital fotoğraf çekimi ile buruşmuş koloni oluşumunun başlangıcında ve geliştirme belgeleyin. Bu deney boyunca görüntü alırken aynı büyütme kullanmak önemlidir. Mikroskobun Mercekten kameranın arkasında bulunan kolu kullanarak bilgisayar ekranına görünümüne geçin. Mercek arasında geçiş yaparkenve bilgisayar ekranında görüntüleme, görünümünü ayarlamak ve buna odaklanmak. </li><li> Görüntüleme benekli kültürler önce, Petri plakasının kapak tipik olarak net görüntü sunmak için çıkarılır. Benekli kültür adımları 2.5 ve 2.6 özetlenen kurulum kullanarak kapaktan imaged olabilir Ancak, bu isteğe bağlı bir adımdır. </li><li> Buruşuk koloni oluşumunun başlangıcında izleyerek her zaman noktasında, buruşuk koloni gelişme desen unutmayın. Mimarisi içten dışa gelişebilir veya Bu değerlendirme inç dışında farklı suşları veya farklı koşullar altında oluşmuş biyofilm ayırt etmek için bir mekanizma sağlar. </li><li> Her bir zaman noktasında gelişmekte koloninin çapı ölçün. Bu elle yapılması veya dijital olarak ilgili yazılım programı kullanılarak yapılabilir. Dijital yapılırsa, Progres CapturePro programı kullanmak ve ilk deneyde kullanılan özel büyütme için ölçekleme çubuğu kalibre. Çekilen her görüntü ölçek bar bulunmaktadır. </li><li> ImageJ yazılım programı kullanarak koloni çapı hesaplamak için, her resim dosyasını açın. Aşağıdaki gibi ölçek çubuğu standartlaştırın: araç çubuğundan &quot;Düz çizgi seçeneğini&quot; seçin. Aynı uzunluk ve genişlik düz bir çizgi ile gömülü ölçek çubuğu Yerleşimi. Etiketli sekmesinden &quot;Set Ölçeği&quot; Seç &quot;analiz edin.&quot; Ve &quot;Tamam&quot; seçeneğini seçin; &quot;bilinen mesafe&quot; kutusunda, (yani, 2 mm olarak orijinal ölçekte çubuğundan belirlenir) karşılık gelen uzunluğu yerleştirin. </li><li> Nokta arasında yatay bir çizgi eklemek için &quot;Düz çizgi&quot; seçeneğini kullanın. Çözümle sekmesi altında, &quot;Tedbir&quot; seçeneğini seçin. Yeni Sonuçlar penceresinde, hesaplanan uzunluğu sağlanacaktır. Nokta arasında bir dik çizgi ekleyerek ikinci bir ölçüm alın. Çapı yeniden hesaplamak. Iki ölçümün ortalama kaydedin. Grafik Excel gibi bir yazılım programı kullanarak her noktada, her nokta için ortalama çapı. </li><li> Deneyin sonunda ya da belirli bir zaman noktasında ya da herhangi bir başka olduğunu ortaya çıkarbiyofilm gelişmesi. Sonuna ulaşıldığında, bu Powerpoint gibi bir yazılım programı kullanarak zamanla deseni geliştirme görselleştirmek için bir rakam (lar) içine görüntüleri birleştirmek. </li></ol> 3. Temsilcisi Sonuçlar Bu deneylerde kullandığımız V. sağlam bir agar yüzeyinde kırışık kolonilerin gelişimi değerlendirerek biyofilm oluşumu incelemek için bir model organizma olarak fischeri. V. Biyofilm üreten suşlar 40 saat içinde kapsamlı 3D mimarisi ile fischeri formu koloniler (Şekil 1) 8,9,14. Bir süre boyunca bakıldığında, kontrol suşu tarafından kırışmış koloni oluşumu yaklaşık 12 kadar erken başlatır belirginleşir saat sonrası aşılama (özel koşullarına bağlı olarak) (Şekil 2) 9. Buna karşılık, bir temsilci mutant tarafından biyofilm oluşumu yaklaşık 16 saat sonrasında aşılama 9 kadar başlatarak değil, yaklaşık 4 saat geciktirilir. Aktarım istasyonlarıBu deneylerin ts 9 Bu değerlendirme yarı kantitatif hale zamanlaması nispeten tutarlı olduğunu ileri sürdü. Biyofilm ikinci bir yarı-nicel ölçü zaman içinde gelişen koloninin çapı değişim kullanımını sağlar. Şek. 3A, temsili bir biyofilm-yetkili suşu koloniler oluşturduğunu karmaşıklığı ve biyofilm oluşturan olmayan bir temsilcisi zorlanma göre çapı artar. Bu iki suş oluşturduğu kolonilerin çapları zaman içinde dikkatli ölçümler, biyofilm-yetkili kolonilerin boyutu biyofilm-negatif koloniler daha büyük oranda arttığını ortaya çıkardı ve bitiş saatini noktada iki neredeyse 2 kat farklılık - kat (Şekil 3B). Bir temsili geç zaman ya da &quot;son nokta&quot; koloni morfolojisinin görüntü sık literatürde gösterilmiştir rağmen Böylece, ek, yarı-nicel veri biyofilm kusurun daha iyi anlaşılması izin verecek bir toplanabilir.<img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig1.jpg" /> Şekil 1. Son-nokta tayini. Bu rakam V. temsilcisi (sağ) non-biyofilm oluşturan (solda) ve biyofilm oluşturan suşlar kullanarak bir son nokta tayinin bir örnektir fischeri. Bu görüntüleri 40 saat post-lekelenme toplanmıştır. Bu görüntüler, vahşi tip V ile üretildi fischeri vektör kontrol (non-biyofilm oluşum) veya set Morris ve ark., 2011 için toplanan verilerin bir RSCS aşırı plazmid (biyofilm oluşturan) ve idi kısmını içeren. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig2.jpg" /> Şekil 2. Zaman kurs testi. Üst panelde bir biyofilm-yetkili kontrolü suşu tarafından biyofilm temsilcisi görüntüleri içerir V. Seçilen bir zaman boyunca fischeri. Biyofilm oluşumunun başlatılması 12 saat belirgindir. Alt panel temsilcisi i içerirV. bir mutant mageler biyofilm 16 saat sonrası aşılama de başlatılması ile zamanla kırışmış koloni oluşumunun başlangıcında bir gecikme (4 saat), sergiler fischeri. Bu ırklar arasındaki ince farkları sadece erken zaman noktalarında tespit edilirken 40 saat suşları, biyofilm oluşumunun yoğunluğu ve desenleme benzer unutmayın. Bu görüntüler RSCS aşırı wild-tip ve sypE mutant ile oluşturulan V. fischeri hücreleri ve veri vardı parçası Morris ve ark için toplanan seti., 2011. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig3.jpg" /> Biyofilm oluşumunun bir yarı-nicel analizi Şekil 3. Koloni çapı. V. temsilcisi biyofilm oluşturan (üst panel) ve non-biyofilm oluşturan (alt panel) suşları tarafından biyofilm oluşumu (A) Zaman kurs fischeri. Biyofilm oluşturan gerginlik büyük bir artış sergileyen unutmayınolmayan biyofilm oluşturan suşu göre zamanla çapı. Bu görüntüler, vahşi tip V ile üretildi bir veri RSCS aşırı plazmid (biyofilm oluşturucu) ya da bir vektör kontrol (non-biyofilm oluşturucu) ve edildi parçası içeren fischeri Morris ve ark., 2011 için toplanmıştır ayarlanır. (B) protokolü belirtildiği gibi bu veriler ImageJ ve Excel yazılımı kullanılarak elde edilmiştir paneli A&#39;da iki suşu tarafından zamanla koloni çapı artış bir grafik gösterimidir.

<ol>
	<li>Donlan, R. M., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+survival+mechanisms+of+clinically+relevant+microorganisms.">Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms.</a> Clin. Microbiol. Rev. 15, 167-167 (2002).</li><li>Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms+as+complex+differentiated+communities.">Biofilms as complex differentiated communities.</a> Annu. Rev. Microbiol. 56, 187 (2002).</li><li>Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+the+matrix+revisited.">Biofilms: the matrix revisited.</a> Trends Microbiol. 13, 20 (2005).</li><li>Branda, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fruiting+body+formation+by+Bacillus+subtilis.">Fruiting body formation by Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11621 (2001).</li><li>Beyhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+rugosity+and+biofilm+formation+in+Vibrio+cholerae:+comparison+of+VpsT+and+VpsR+regulons+and+epistasis+analysis+of+vpsT,+vpsR,+and+hapR.">Regulation of rugosity and biofilm formation in Vibrio cholerae: comparison of VpsT and VpsR regulons and epistasis analysis of vpsT, vpsR, and hapR.</a> J. Bacteriol. 189, 388 (2007).</li><li>Enos-Berlage, J. L., Guvener, Z. T., Keenan, C. E., McCarter, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+determinants+of+biofilm+development+of+opaque+and+translucent+Vibrio+parahaemolyticus.">Genetic determinants of biofilm development of opaque and translucent Vibrio parahaemolyticus.</a> Mol. Microbiol. 55, 1160 (2005).</li><li>Merritt, J. H., Brothers, K. M., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SadC+reciprocally+influences+biofilm+formation+and+swarming+motility+via+modulation+of+exopolysaccharide+production+and+flagellar+function.">SadC reciprocally influences biofilm formation and swarming motility via modulation of exopolysaccharide production and flagellar function.</a> J. Bacteriol. 189, 8154-8154 (2007).</li><li>Yip, E. S., Geszvain, K., DeLoney-Marino, C. R., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+symbiosis+regulator+rscS+controls+the+syp+gene+locus,+biofilm+formation+and+symbiotic+aggregation+by+Vibrio+fischeri.">The symbiosis regulator rscS controls the syp gene locus, biofilm formation and symbiotic aggregation by Vibrio fischeri.</a> Mol. Microbiol. 62, 1586-1586 (2006).</li><li>Morris, A. R., Darnell, C. L., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+a+novel+response+regulator+is+necessary+for+biofilm+formation+and+host+colonization+by+Vibrio+fischeri.">Inactivation of a novel response regulator is necessary for biofilm formation and host colonization by Vibrio fischeri.</a> Mol. Microbiol. 82, 114 (2011).</li><li>Nyholm, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+Vibrio+fischeri+and+nonsymbiotic+bacteria+in+the+dynamics+of+mucus+secretion+during+symbiont+colonization+of+the+Euprymna+scolopes+light+organ.">Roles of Vibrio fischeri and nonsymbiotic bacteria in the dynamics of mucus secretion during symbiont colonization of the Euprymna scolopes light organ.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 5113 (2002).</li><li>Yip, E. S., Grublesky, B. T., Hussa, E. A., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+conserved+cluster+of+genes+promotes+symbiotic+colonization+and+Ï&#x0192;54-dependent+biofilm+formation+by+Vibrio+fischeri.">A novel, conserved cluster of genes promotes symbiotic colonization and Ï&#x0192;54-dependent biofilm formation by Vibrio fischeri.</a> Mol. Microbiol. 57, 1485 (2005).</li><li>Mandel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+regulatory+gene+is+sufficient+to+alter+bacterial+host+range.">A single regulatory gene is sufficient to alter bacterial host range.</a> Nature. 458, 215 (2009).</li><li>Graf, J., Dunlap, P. V., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+transposon-induced+motility+mutations+on+colonization+of+the+host+light+organ+by+Vibrio+fischeri.">Effect of transposon-induced motility mutations on colonization of the host light organ by Vibrio fischeri.</a> J. Bacteriol. 176, 6986 (1994).</li><li>Geszvain, K., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hybrid+sensor+kinase+RscS+integrates+positive+and+negative+signals+to+modulate+biofilm+formation+in+Vibrio+fischeri.">The hybrid sensor kinase RscS integrates positive and negative signals to modulate biofilm formation in Vibrio fischeri.</a> J. Bacteriol. 190, 4437 (2008).</li><li>Krasteva, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+cholerae+VpsT+regulates+matrix+production+and+motility+by+directly+sensing+cyclic+di-GMP.">Vibrio cholerae VpsT regulates matrix production and motility by directly sensing cyclic di-GMP.</a> Science. 327, 866 (2010).</li><li>Romling, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+rdar+morphotype,+a+multicellular+behaviour+in+Enterobacteriaceae.">Characterization of the rdar morphotype, a multicellular behaviour in Enterobacteriaceae.</a> Cell Mol. Life. Sci. 62, 1234 (2005).</li><li>Berleman, J. E., Chumley, T., Cheung, P., Kirby, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rippling+is+a+predatory+behavior+in+Myxococcus+xanthus.">Rippling is a predatory behavior in Myxococcus xanthus.</a> J. Bacteriol. 188, 5888 (2006).</li><li>Lee, K., Veeranagouda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicrocells+form+by+reductive+division+in+macroscopic+Pseudomonas+aerial+structures.">Ultramicrocells form by reductive division in macroscopic Pseudomonas aerial structures.</a> Environ. Microbiol. 11, 1117 (2009).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu çalışmada, biyofilm kullanarak değerlendirmek için bir yarı-nicel yöntemi tarif V. bir model organizma olarak fischeri. Özellikle, katı agar yüzeyinde zamanla kırışmış koloni oluşumu gibi biyofilm oluşumunu ve gelişimini izlemek üzere kamera eki olan bir mikroskop kullanmaktadır. Bu protokol, biz yaygın kırışık koloni gelişimi değerlendirmek için kullanabilecekleri yöntemleri iki belirli türleri özetlemektedir. Bizi ilk önce seçilen bir &quot;nihai&quot; bir zaman noktasında son, genel 3D mimari, desenleme ve benekli bir kültür çapı gözlemlemek sağlar son nokta testi vardır. Bu yaklaşım, biyofilm oluşumu dramatik kusurlarına yol mutant suşlar veya koşulları değerlendirmek için çok kullanışlı olur. Ancak, bu yaklaşım seçilen son nokta önce zaman noktalarında meydana gelen daha ince farkları ayırt etmez. Daha yakından kırışmış koloni oluşumu izlemek için, bize w başlangıcını tanımlayabilirsiniz bir zaman tabii tayini, kullanmakzamanla koloni oluşumu ve gelişimi izlemek rinkled. Bu yaklaşımın bir sonucu olarak, buruşuk koloni oluşumu, 3 boyutlu mimari modelleme ve zamanlaması daha ince farklar tespit edilebilir. Biz biyofilm oluşumu iki yarı-kantitatif testler oluşturmak için bu kez ders testi kullanılır. Öncelikle, bir gerginlik 3D mimarisi geliştirmek için başladığı zaman kontrol suşları ile karşılaştırıldığında edilebilir. Aynı koşullar altında, belirli bir mutantı biyofilm gecikme 9 oldukça tutarlı olduğunu bulduk. Örneğin, Şekil l&#39;de gösterilen veriler. 2, mutant sürekli biyofilm oluşumunu başlatmada bir 4 saat gecikme hakkında sergiledi. Biyofilm ikinci bir yarı-nicel ölçü buruşmuş koloni (spot) çapının büyüklüğü değişimdir. Biz (Şekil 3 buruşuk kolonilerin çapı giderek bitiş zamanını noktada, bir 2-kat farkı yaklaşık ulaşan, non-biyofilm koloniler farklıdır olduğunu bulduk </strong&gt;) (Morris ve Visick, yayınlanmamış veri). Bazı mutantlar farklı davranır mümkün kalmasına rağmen bugüne kadar, biz, (yayınlanmamış veri) (yani, koloni çapı bir artış olmadan biyofilm) diğeri olmadan fenotipi tespit değil. Gerçekten de, V. için rapor edilmiştir koloni çapı önemli bir artış bazı kırışmış koloniler sonucu diğerleri 15 yok ederken bu cholerae. Yine de, zaman içinde çapı değişim değerlendirmek potansiyeli biyofilm mutantlarının ve / veya yardımcı karakterizasyonu gelişimi gecikme ile mutantların ek bir miktar ölçü sağlayabilir. Biyofilm iki önlemler (süresi ve çap) arasında, buruşuk koloni oluşumunun başlangıç ​​belirlenmesi spot çapı belirleyici değil, aynı zamanda daha sübjektif daha duyarlıdır fakat. Böyle bile olsa, iki tedbirler biyofilm araştırmacılar için son derece yararlı ama quantificatio için kolayca uygun olmayan bir fenotip bir yarı-nicel değerlendirmesini sağlamakn. Benekli kültür testleri yaparken, benekli suşları kültüre hangi çevre koşullarının dikkate alınması önemlidir. Buruşuk koloni oluşumu genellikle bitki besin, sıcaklık ve nem dahil olmak üzere çeşitli çevresel koşullar tarafından etkilenir. Deneyler arasındaki değişkenliği azaltmak için, mümkün olduğu kadar (yani bir ayarlanan ses agar standartlaştırılması ve kontrollü bir sıcaklıkta kültür lekeli suşlar) bu koşulları standardize etmek yararlı olur. Lekelenme deneyler arasındaki değişkenliği daha fazla kontrol için deneyler her set içinde uygun kontrol suşları dahil etmek önemlidir. Son olarak, bu deneyler gelen verilerin yorumlamak zaman, buruşuk koloni oluşumu belirgin şekilde farklıdır (örn., biyofilm ya desen farklılıklar bir gecikme) değerlendirmek özellikle herhangi bir deneyde birkaç kez (3 +), gerçekleştirmek için gereklidir. Bu protokolün bazı sınırlamalar şunlardır: 1) determinhücrelerinin büyümesini bir kusur olup olmadığını ing zor olabilir: Sıvı kültürdeki hücre büyümesi doğru büyüme katı besiyerinde oranları ve mümkün olmayabilir, birbirine yapışabilir biyofilm oluşturan hücrelerin, büyüme doğru bir tespiti yansıtmıyor olabilir; 2) büyüme defektleri ile suşlar analiz etmek için sorunlu olacaktır; 3) ince bir biyofilm fenotipleri ile suşlar arasındaki çap farkı ayırt etmek mümkün olmayabilir; 4) konsantrik halka uzamıyor suşları için doğru bir şekilde ölçmek mümkün olmayabilir çaplı değişiklikler; Bu deneysel set-up ile biyofilm Z-boyutu ölçmek için hiçbir şekilde orada) ve 6, 5) desenlendirme biyofilm oluşumu sırasında görülebilir iken, orada çıkan biyofilm desen ölçmek için bir yol yoktur . Bu kısıtlamalara rağmen, bu protokol yine buruşuk koloni oluşumu değerlendirilmesinde yardımcı olması için sayısal veri elde etmek için bir araç sağlar. Bu protokol, biz özel bir görüntüleme kullananSistem kırışmış koloni gelişimi gözlemlemek ve değerlendirmek için (yani, bir Zeiss diseksiyon mikroskobu ve Progres CapturePro görüntüleme yazılımı). Kırışmış, koloni oluşumunun başlangıcında tespit ve böylece bir süre ders yaklaşımı ile gelişimini değerlendirmek yeteneği büyük ölçüde bir mikroskop kullanılarak geliştirilmiştir: Burada anlatılan görüntüleme sistemi güçlüdür. Bu teknoloji kullanılamıyor, ancak protokolü bir zoom odaklı basit bir dijital kamera da dahil olmak üzere diğer ekipman ile kullanım için adapte edilebilir. Bu protokol kırışmış koloni gelişiminin değerlendirilmesi odaklanırken, aynı zamanda ince tabakanın oluşumu, hücre sıvısı kültürü statik olduğu zamanlarda gelişir biyofilm bir formu değerlendirmek için modifiye edilebilir. Bu protokol ayrıca biyofilm gelişimi sırasında benekli kolonilere özel boyalar ile birleşmesiyle içeren biyofilm oluşumu diğer göstergeleri, değerlendirilmesinde yararlı olabilir. Bunlar arasında, ancak bu tür Congo Red ve calcoflu olarak boyalar, bunlarla sınırlı değildirya da bu selüloz, 16 bakteriyel biyofilmlerin ortak bir bileşeni ile bağlanabilirler. Ayrıca, bu protokol, kullanım için geliştirilmiş olmasına rağmen V. fischeri, bu organizma ile sınırlı değil ama bu tür Bacillus subtilis 4, Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6, 7 ve Pseudomonas aeruginosa, tüm sergi buruşuk koloni oluşumu gibi birçok farklı organizmalar içinde biyofilm okuyan jeneralize olabilir. Son olarak, ayrıca Pseudomonas aeruginosa 18 Myxococcus Xanthus 17 büyüme ve hava yapısı gelişimi sırasında meydana desenleme, potansiyel olarak bir gelişme modeli, sahip diğer koloni morfolojileri çalışmaya adapte edilebilir. Bu protokol, mikrobiyoloji ve biyofilm araştırmacılar için genel kullanım dolayısıyla olduğunu.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Ekipman Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Zeiss STEMI 2000-C Mikroskop Dissecting </td><td> Zeiss </td><td> 45505300000000000 </td><td> (Lukas Mikroskop ile elde edilen) </td></tr><tr><td> Progres C10 PLUS </td><td> Jenoptik Optik Systems GmbH </td><td> 017953-602-26 </td><td> Kamera eki (Lukas Mikroskop ile elde edilen) </td></tr><tr><td> CL 1500 EC Soğuk Işık Kaynağı </td><td> Zeiss </td><td> 4355400000000000 </td><td> (Lukas Mikroskop ile elde edilen) </td></tr><tr><td> Progres CapturePro </td><td> Jenoptik Optik Systems GmbH </td><td> Kayıtlı kamera ile ücretsiz yazılım </td><td> Görüntü yakalama için bilgisayar programı </td></tr><tr><td> Görüntü J </td><td> NIH </td><td> Den Ücretsiz yazılım:ij / download &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html </td><td> Çap ölçümleri için bilgisayar programı </td></tr></tbody></table>

a semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development

Biyofilmler, ya bir hücre dışı matris içinde kapsüllendiği hücre yüzeyi bağlı topluluklar, birçok bakteri için ortak bir yaşam biçimi temsil eder. Bir biyofilm içinde, bakteri hücrelerinin genellikle antibiyotik ve diğer çevresel streslere 1 ile geliştirilmiş direnç dahil olmak üzere, fizyolojisi değişmiş sergilemektedir. Ayrıca, biyofilm konak-mikrop ilişkisi önemli rol oynayabilir. Biyofilmler bireysel zaman bakteri geçişi geliştirmek, planktonik hücreler kompleks, çok hücreli topluluklar 2 oluşturur. Laboratuvarda, biyofilm özel biyofilm fenotipleri gelişimini değerlendirerek incelenmektedir. Yaygın bir fenotip biyofilm katı agar ortamı üzerine 3 kırışık ya da buruşuk bakteri kolonileri oluşturulmasını içerir. Buruşuk koloni oluşumu tanımlayıp karakterize değişmiş biyofilm fenotipi gösteren bakteri türleri ve etkileri biyofilm oluşumu, çevresel koşulların araştırılması için özellikle basit ve kullanışlı bir araç sağlar. Wrinkled koloni oluşumu gibi bu tür Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6, Pseudomonas aeruginosa 7 gibi Bacillus subtilis 4, ve Gram-negatif bakteriler gibi Gram pozitif bakteriler, her iki dahil olmak üzere bakteriler, çeşitli in biyofilm bir göstergesi olarak hizmet eder, ve Vibrio fischeri 8. Deniz bakterisi V. fischeri ana kolonizasyon sırasında biyofilmlerin kritik rolü nedeniyle biyofilm oluşumu için bir model haline gelmiştir: tarafından üretilen Biyofilmler V. fischeri Hawaiian Bobteyli kalamar Euprymna scolopes 8-10 onun kolonizasyon teşvik. Önemli olarak, in vitro olarak gözlenen fenotipin biyofilm V. yeteneği ile ilişkili fischeri hücreleri etkin konak hayvanların kolonize: suşları artış sergileyerek ise in vitro biyofilm engelliler için suşları, bir kolonizasyon kusur 9,11 sahipbiyofilm fenotipleri kolonizasyon 8,12 için geliştiriliyor. V. fischeri nedenle bakteri biyofilm oluşumu ve biyofilm nasıl etki sahibi kolonizasyon düzenleyen hangi mekanizma ile değerlendirmek için basit bir model sistemi sağlar. Bu yazıda, biyofilm kullanarak değerlendirmek için bir yarı-nicel yöntemi tarif V. bir model sistem olarak fischeri. Bu yöntem katı agar besiyerlerine tanımlanan konsantrasyonları ve hacimleri az bakteri kültürlerinin lekelenme dikkatli içerir; benekli bir kültürün, tek bir bakteri kolonisi eş anlamlıdır. Bu &#39;lekeli kültürü&#39; tekniği tek, belirli zaman noktalarında (uç nokta analizleri) gayri safi biyofilm fenotipleri karşılaştırmak veya koloni çapı biyofilm gelişmesi ve ölçümlerin zaman tabii testler aracılığıyla ince biyofilm fenotipleri belirlemek ve karakterize etmek için kullanılabilir , hangi biyofilm oluşumu etkilenir. Böylece, bu teknik başına, biyofilm bir yarı-nicelik açısındanburuşuk koloni gelişimi ve gelişen yapısı, basit genel morfolojisi ötesine özelliklerinin göreli büyüklüğü zamanlaması ve desenlendirme değerlendirilmesi mitting.

Watch this Scientific Journal Video about A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development at JoVE.com

A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

Biz biyofilm oluşumunu araştırmak için basit, yarı-nicel yöntem sağlamak<em&gt; In vitro</em&gt;. Bu yöntem-C 2000 zamanlama ve biyofilm oluşumu desen hem de izlemek için (kamera eklentisi ile) Mikroskop diseksiyon gibi buruşmuş kolonilerin gelişimi değerlendirildi Zeiss STEMI yararlanır.

Buruşuk Koloni Gelişimi kullanarak Biyofilm Oluşumu değerlendirin Bir Yarı-kantitatif Yaklaşım

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

Tümör Hücrelerinin vaskülojenik Faaliyet değerlendirin bir Matrigel Tabanlı Tüp Oluşumu Testi

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Bir Multiplex Antikor Tarama Yöntemi kullanılarak bir Luminex xMAP Tahlil için bir Capture ELISA Dönüşüm

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Zebra balığı Geliştirme Sırasında Photoconvertible Proteinler kullanma Cep Takip

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Blastomer Eksplantlarından Embriyonik gelişim sırasında Hücre Kader Taahhüt Test Etmek için

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

Bıldırcın-ördek Chimeras kullanma Kraniyofasiyal Kalkınma için Türlere özgü Katılımlar değerlendirilmesi

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

The Soft Agar Colony Formation Assay

Yumuşak Agar koloni formasyon deneyi

Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

Gap Junctional Hücreler arası iletişim: Doğal Ürünler Toksikantların ve Toksinler Yan Etkileri değerlendirmek için Fonksiyonel Biyomarker ve Sağlık Faydaları

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

A Simple Approach to Perform TEER Measurements Using a Self-Made Volt-Amperemeter with Programmable Output Frequency

Programlanabilir Çıkış Frekansı Ile Kendi Kendine Yapılmış Volt-Ampermetre Kullanarak TEER Ölçümlerini Gerçekleştirmek Için Basit Bir Yaklaşım

Transepithelial/endothelial electrical resistance (TEER) has been used since the 1980s to determine confluency and permeability of in vitro barrier model ...

Development of an Individual-Tree Basal Area Increment Model using a Linear Mixed-Effects Approach

Doğrusal Karma EfektLer Yaklaşımı Kullanılarak Tek Tek Ağaç Bazal Alan Artış Modelinin Geliştirilmesi

Here, we developed an individual-tree model of 5-year basal area increments based on a dataset including 21898 Picea asperata trees from 779 sample plots ...

A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior

Kemirgen Davranışı Üzerindeki Genetik Etkileri Sorgulamak için İkili İn Utero Elektroporasyonunu Kullanan Bir Boru Hattı

As genome-wide association studies shed light on the heterogeneous genetic underpinnings of many neurological diseases, the need to study the contribution ...