Name: a convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells
Uploaded: 2012-07-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells at JoVE.com

وأيد هذا العمل من قبل علاج فيروس نقص المناعة البشرية أونتاريو جرانت شبكة التشغيل البحوث (ROG-G645)، والمعاهد الكندية لأبحاث الصحة جائزة محقق جديد (MSH-113554) لJEL، وجامعة تورنتو الزمالات إلى HA، الهيئة الاتحادية للجمارك، واللجنة التأديبية المشتركة. فإن الكتاب أود أن أشكر مارني فوسكو، أبيلسون الدفنة والدكتورة إيريكا سافيري Ollmann في معهد سكريبس للبحوث (لا جولا، كاليفورنيا) لخلايا توفير، ebolavirus ناقلات التعبير GP ونصائح عامة.

1. أعمال إعداد - يبني والثقافات الخلية قبل البدء في بروتوكول، يجب أن تكون الجينات التي تهم كودون-الأمثل للتعبير في خلايا الثدييات، والمستنسخة في متجه التعبير المناسب باستخدام معيار تقنيات البيولوجيا الجزيئية. من أجل ضمان أعلى مست?...

<ol>
	<li>Celik, E., Calik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+proteins+by+yeast+cells.">Production of recombinant proteins by yeast cells.</a> Biotechnol. Adv. , (2011).</li><li>Yokoyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+expression+systems+for+structural+genomics+and+proteomics.">Protein expression systems for structural genomics and proteomics.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 7, 39-43 (2003).</li><li>Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+production+of+proteins+in+insect+and+mammalian+cells+for+structural+biology.">Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology.</a> J. Struct. Biol. 172, 55-65 (2010).</li><li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+Applications+come+of+age.">Cell-free protein synthesis: Applications come of age.</a> Biotechnol. Adv. , (2011).</li><li>Lee, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Ebola+virus+glycoprotein+bound+to+an+antibody+from+a+human+survivor.">Structure of the Ebola virus glycoprotein bound to an antibody from a human survivor.</a> Nature. 454, 177-182 (2008).</li><li>Bowden, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+Nipah+and+Hendra+virus+attachment+to+their+cell-surface+receptor+ephrin-B2.">Structural basis of Nipah and Hendra virus attachment to their cell-surface receptor ephrin-B2.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 15, 567-572 (2008).</li><li>Evans, M. J., Hartman, S. L., Wolff, D. W., Rollins, S. A., Squinto, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+expression+of+an+anti-human+C5+chimeric+Fab+utilizing+a+vector+that+replicates+in+COS+and+293+cells.">Rapid expression of an anti-human C5 chimeric Fab utilizing a vector that replicates in COS and 293 cells.</a> J. Immunol. Methods. 184, 123-138 (1995).</li><li>Ye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+protein+expression+in+scalable+CHO+transient+transfection.">High-level protein expression in scalable CHO transient transfection.</a> Biotechnol. Bioeng. 103, 542-551 (2009).</li><li>Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+protein+therapeutics+in+cultivated+mammalian+cells.">Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells.</a> Nat Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).</li><li>Lee, J. E., Fusco, M. H., Hessell, A. J., Burton, D. R., Saphire, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+and+tactics+used+in+determining+the+structure+of+trimeric,+prefusion+Ebola+virus+GP.">Techniques and tactics used in determining the structure of trimeric, prefusion Ebola virus GP.</a> Acta Cryst. 65, 1162-1180 (2009).</li><li>Aricescu, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+expression:+developments+for+structural+proteomics.">Eukaryotic expression: developments for structural proteomics.</a> Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 62, 1114-1124 (2006).</li><li>Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-+and+cost-efficient+system+for+high-level+protein+production+in+mammalian+cells.">A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells.</a> Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. D62, 1243-1250 (2006).</li><li>Chang, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoprotein+structural+genomics:+solving+the+glycosylation+problem.">Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem.</a> Structure. 15, 267-273 (2007).</li><li>Lee, J. E., Fusco, M. H., Saphire, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+platform+for+screening+expression+and+crystallization+of+glycoproteins+produced+in+human+cells.">An efficient platform for screening expression and crystallization of glycoproteins produced in human cells.</a> Nature Protocols. 4, 592-604 (2009).</li><li>Nettleship, J. E., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+production+of+glycoproteins+by+transient+expression+in+Mammalian+cells.">The production of glycoproteins by transient expression in Mammalian cells.</a> Methods Mol. Biol. 498, 245-263 (2009).</li><li>Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetherin+inhibits+retrovirus+release+and+is+antagonized+by+HIV-1+Vpu.">Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu.</a> Nature. 451, 425-430 (2008).</li><li>Nakamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterodimerization+of+the+IL-2+receptor+beta-+and+gamma-chain+cytoplasmic+domains+is+required+for+signalling.">Heterodimerization of the IL-2 receptor beta- and gamma-chain cytoplasmic domains is required for signalling.</a> Nature. 369, 330-333 (1994).</li><li>Wang, X., Rickert, M., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+quaternary+complex+of+interleukin-2+with+its+alpha,+beta,+and+gammac+receptors.">Structure of the quaternary complex of interleukin-2 with its alpha, beta, and gammac receptors.</a> Science. 310, 1159-1163 (2005).</li></ol>

المصانع الخلية 10 طبقة هي سفينة فعالة لإنتاج كميات مليغرام من البروتين. والميزة الرئيسية لاستخدام مصنع الخلية على السفن التقليدية الأخرى، مثل زجاجات الدوارة، وقوارير هزة أو الدوار القوارير، هو أنها لا تحتاج لشراء أي معدات مختبر إضافية. وهناك معيار CO 2 الحاضنة (~...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> الفوسفاتيز القلوية (BCIP / NBT) حل الركيزة السائل </td><td> سيغما </td><td> B6404 </td><td></td></tr><tr><td> مضاد حيوي / مضاد فطري، 100X </td><td> إينفيتروجن </td><td> 15240062 </td><td></td></tr><tr><td> مكافحة HA تقارب مصفوفة، استنساخ 3F10 </td><td> روش </td><td> 1815016 </td><td></td></tr><tr><td> مكافحة الفئران خريطة موقع HA، استنساخ 16B12 </td><td> كوفانس </td><td> MMS-101P </td><td></td></tr><tr><td> خلية قارورة والثقافة، وتعامل T75 ثقافة سم الأنسجة 2 </td><td> كورنينج </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> خلية قارورة والثقافة، وتعامل T225 ثقافة سم الأنسجة 2 </td><td> كورنينج </td><td> 431082 </td><td></td></tr><tr><td>لوحات ثقافة خلية ،6-جيدا زراعة الأنسجة المعالجة </td><td> كورنينج </td><td> 3516 </td><td></td></tr><tr><td> مصنع الخلية، 10 طبقة CellSTACK </td><td> كورنينج </td><td> 3312 </td><td></td></tr><tr><td> Centramate أوميغا 5K كاسيت </td><td> غطاء النعش </td><td> OS005C12 </td><td></td></tr><tr><td> Centramate أوميغا 30K كاسيت </td><td> غطاء النعش </td><td> OS030C12 </td><td></td></tr><tr><td> اللوني الزجاج عمود، الطول 1.0x10 </td><td> Kontes </td><td> 4204001010 </td><td></td></tr><tr><td> سيبروفلوكساسين </td><td> سيغما </td><td> 17850 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco لتعديل النسر وسائل الاعلام (DMEM) </td><td> سيغما </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> مصل بقري جنيني (FBS)، والحرارة المعطل </td><td> إينفيتروجن </td><td> 12484-028 </td><td></td></tr><tr><td> الكاشف HD ترنسفكأيشن </td><td> Promega </td><td> 4709691001 </td><td></td></tr><tr><td> GeneJuice ترنسفكأيشن الكاشف </td><td> EMD / ميرك </td><td> 70967-6 </td><td></td></tr><tr><td> جليكاين </td><td> سيغما </td><td> G8898 </td><td></td></tr><tr><td> ماعز مكافحة فأر مفتش F (&#39;أب) 2 القلوية </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 31324 </td><td></td></tr><tr><td> الفوسفاتيز، مترافق الأضداد </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> راصة دموية (HA) الببتيد، 100 ملغ </td><td> Genscript </td><td> عرف توليف </td><td></td></tr><tr><td> (تسلسل: YPYDVPDYA؛ نقاء 95٪) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> كلوة الجنين البشري خلايا 293T </td><td> ATCC </td><td> CRL-11268 </td><td></td></tr><tr><td> Householد مبيض (4٪ وزن / هيبوكلوريت الصوديوم) </td><td> مختلف العلامات التجارية المتاحة </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Immobilon-P PVDF غشاء </td><td> ميليبور </td><td> IPVH07850 </td><td></td></tr><tr><td> MiniPrep عدة تنقية البلازميد، PureLink سريعة </td><td> إينفيتروجن </td><td> K2100-11 </td><td></td></tr><tr><td> MaxiPrep عدة تنقية البلازميد، PureLink HiPure </td><td> إينفيتروجن </td><td> K2100-07 </td><td></td></tr><tr><td> نان 3 </td><td> سيغما </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> pDISPLAY التعبير ناقلات </td><td> إينفيتروجن </td><td> V660-20 </td><td></td></tr><tr><td> البنسلين / الستربتومايسين (القلم / بكتيريا)، 100X </td><td> إينفيتروجن </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، معقم 1X </td><td> سيغما </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> Polyethyleneimine (PEI)، وخطي 25 كيلو دالتون </td><td> Polyscience </td><td> 23966 </td><td></td></tr><tr><td> المقشود مسحوق الحليب الجاف </td><td> قرنفل </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stericup-GP الترشيح فراغ الدائرة العامة وحدة، </td><td> ميليبور </td><td> SCGPU05RE </td><td></td></tr><tr><td> 0.22 ميكرون، سعة 500 مل </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> زرقة التريبان </td><td> إينفيتروجن </td><td> 15250061 </td><td></td></tr><tr><td> التربسين، EDTA، 0.05٪ (W / V) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> توين-20 </td><td> سيغما </td><td> P7949 </td><td></td></tr><tr><td> فالبرويك حمض </td><td> سيغما </td><td> P4543 </td><td></td></tr><tr><td> Centramate عرضية نظام تدفق </td><td> غطاء النعش </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CO 2 حاضنة مرطب، ومعيار 6.0 متر مكعب. قدم </td><td> مختلف العلامات التجارية المتاحة </td><td></td><td></td></tr><tr><td> الكهربائي ونقل وحدة </td><td> مختلف العلامات التجارية المتاحة </td><td></td><td></td></tr><tr><td> حاضنة و 37 درجة مئوية </td><td> مختلف العلامات التجارية المتاحة </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. However, prokaryotic hosts are often not as appropriate for expression of human, viral or eukaryotic proteins due to toxicity of the foreign macromolecule, differences in the protein folding machinery, or due to the lack of particular co- or post-translational modifications in bacteria. Expression systems based on yeast (P. pastoris or S. cerevisiae) 1,2, baculovirus-infected insect (S. frugiperda or T. ni) cells 3, and cell-free in vitro translation systems 2,4 have been successfully used to produce mammalian proteins. Intuitively, the best match is to use a mammalian host to ensure the production of recombinant proteins that contain the proper post-translational modifications. A number of mammalian cell lines (Human Embryonic Kidney (HEK) 293, CV-1 cells in Origin carrying the SV40 larget T-antigen (COS), Chinese Hamster Ovary (CHO), and others) have been successfully utilized to overexpress milligram quantities of a number of human proteins 5-9. However, the advantages of using mammalian cells are often countered by higher costs, requirement of specialized laboratory equipment, lower protein yields, and lengthy times to develop stable expression cell lines. Increasing yield and producing proteins faster, while keeping costs low, are major factors for many academic and commercial laboratories.
Here, we describe a time- and cost-efficient, two-part procedure for the expression of secreted human proteins from adherent HEK 293T cells. This system is capable of producing microgram to milligram quantities of functional protein for structural, biophysical and biochemical studies. The first part, multiple constructs of the gene of interest are produced in parallel and transiently transfected into adherent HEK 293T cells in small scale. The detection and analysis of recombinant protein secreted into the cell culture medium is performed by western blot analysis using commercially available antibodies directed against a vector-encoded protein purification tag. Subsequently, suitable constructs for large-scale protein production are transiently transfected using polyethyleneimine (PEI) in 10-layer cell factories. Proteins secreted into litre-volumes of conditioned medium are concentrated into manageable amounts using tangential flow filtration, followed by purification by anti-HA affinity chromatography. The utility of this platform is proven by its ability to express milligram quantities of cytokines, cytokine receptors, cell surface receptors, intrinsic restriction factors, and viral glycoproteins. This method was also successfully used in the structural determination of the trimeric ebolavirus glycoprotein 5,10.
In conclusion, this platform offers ease of use, speed and scalability while maximizing protein quality and functionality. Moreover, no additional equipment, other than a standard humidified CO2 incubator, is required. This procedure may be rapidly expanded to systems of greater complexity, such as co-expression of protein complexes, antigens and antibodies, production of virus-like particles for vaccines, or production of adenoviruses or lentiviruses for transduction of difficult cell lines.

Watch this Scientific Journal Video about A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells at JoVE.com

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

في عصر ما بعد الجينوم البشري، وتوافر البروتينات المؤتلف في التشكل الأصلية أمر حاسم لبحث الهيكلية والوظيفية والعلاجية والتنمية. هنا، نحن تصف تجارب واسعة النطاق نظام التعبير بروتين في الخلايا الجنينية البشرية 293T الكلى التي يمكن استخدامها لإنتاج مجموعة متنوعة من البروتينات المؤتلف.

ومنهاج عمل مريحة والتعبير العام لانتاج البروتينات يفرز من خلايا الإنسان

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

انتشار الخلايا الجنينية البشرية (ES) الجذعية

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

التحضير لزراعة الخلايا المكونة للدم الابتدائية من نخاع عظام الفئران لElectroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

باستخدام الجينات Electroporation MXcell بولسير النظام لTransfect الخلايا الأولية ذات الكفاءة العالية

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

على البروتين MultiBac مجمع منصة الإنتاج في EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Agroinfiltration كفاءة من النباتات للتعبير عابر الرفيع المستوى من البروتينات المؤتلف

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

كفاءة الإنتاج وتنقية المؤتلف الفئران Kindlin-3 من خلايا الحشرات للدراسات البيوفيزيائية

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

إثراء خارج الخلية مصفوفة البروتينات من الأنسجة والهضم في الببتيدات لتحليل الطيف الكتلي

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

ارتفاع العائد التعبير عن البروتينات المؤتلف الإنسان مع عابر ترنسفكأيشن من خلايا HEK293 في تعليق

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...