Name: a convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells
Uploaded: 2012-07-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af en Ontario hiv-behandling Network Research driftstilskud (ROG-G645) og canadiske Institutes of Health Research New Investigator Award (MSH-113.554) til JEL, og University of Toronto stipendier til HA, FCA, og JDC. Forfatterne vil gerne takke Marnie Fusco, Dafna Abelson og Dr. Erica Ollmann Saphire på The Scripps Research Institute (La Jolla, CA) for at give celler, ebolavirus GP ekspressionsvektoren og generel rådgivning.

1. Forberedende arbejde - konstruktioner og cellekulturer Før start protokollen skal genet af interesse være kodon-optimeret til ekspression i pattedyrceller, og klonet ind i en passende ekspressionsvektor ved anvendelse af standard molekylærbiologiske teknikker. For at sikre den højeste chance for vellykket ekspression bør multiple varianter af genet af interesse blive genereret. Mange mammale ekspressionsvektorer er kommercielt tilgængelige og har forskellige oprensningsmetoder tags (p...

<ol>
	<li>Celik, E., Calik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+proteins+by+yeast+cells.">Production of recombinant proteins by yeast cells.</a> Biotechnol. Adv. , (2011).</li><li>Yokoyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+expression+systems+for+structural+genomics+and+proteomics.">Protein expression systems for structural genomics and proteomics.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 7, 39-43 (2003).</li><li>Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+production+of+proteins+in+insect+and+mammalian+cells+for+structural+biology.">Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology.</a> J. Struct. Biol. 172, 55-65 (2010).</li><li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+Applications+come+of+age.">Cell-free protein synthesis: Applications come of age.</a> Biotechnol. Adv. , (2011).</li><li>Lee, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Ebola+virus+glycoprotein+bound+to+an+antibody+from+a+human+survivor.">Structure of the Ebola virus glycoprotein bound to an antibody from a human survivor.</a> Nature. 454, 177-182 (2008).</li><li>Bowden, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+Nipah+and+Hendra+virus+attachment+to+their+cell-surface+receptor+ephrin-B2.">Structural basis of Nipah and Hendra virus attachment to their cell-surface receptor ephrin-B2.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 15, 567-572 (2008).</li><li>Evans, M. J., Hartman, S. L., Wolff, D. W., Rollins, S. A., Squinto, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+expression+of+an+anti-human+C5+chimeric+Fab+utilizing+a+vector+that+replicates+in+COS+and+293+cells.">Rapid expression of an anti-human C5 chimeric Fab utilizing a vector that replicates in COS and 293 cells.</a> J. Immunol. Methods. 184, 123-138 (1995).</li><li>Ye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+protein+expression+in+scalable+CHO+transient+transfection.">High-level protein expression in scalable CHO transient transfection.</a> Biotechnol. Bioeng. 103, 542-551 (2009).</li><li>Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+protein+therapeutics+in+cultivated+mammalian+cells.">Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells.</a> Nat Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).</li><li>Lee, J. E., Fusco, M. H., Hessell, A. J., Burton, D. R., Saphire, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+and+tactics+used+in+determining+the+structure+of+trimeric,+prefusion+Ebola+virus+GP.">Techniques and tactics used in determining the structure of trimeric, prefusion Ebola virus GP.</a> Acta Cryst. 65, 1162-1180 (2009).</li><li>Aricescu, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+expression:+developments+for+structural+proteomics.">Eukaryotic expression: developments for structural proteomics.</a> Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 62, 1114-1124 (2006).</li><li>Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-+and+cost-efficient+system+for+high-level+protein+production+in+mammalian+cells.">A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells.</a> Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. D62, 1243-1250 (2006).</li><li>Chang, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoprotein+structural+genomics:+solving+the+glycosylation+problem.">Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem.</a> Structure. 15, 267-273 (2007).</li><li>Lee, J. E., Fusco, M. H., Saphire, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+platform+for+screening+expression+and+crystallization+of+glycoproteins+produced+in+human+cells.">An efficient platform for screening expression and crystallization of glycoproteins produced in human cells.</a> Nature Protocols. 4, 592-604 (2009).</li><li>Nettleship, J. E., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+production+of+glycoproteins+by+transient+expression+in+Mammalian+cells.">The production of glycoproteins by transient expression in Mammalian cells.</a> Methods Mol. Biol. 498, 245-263 (2009).</li><li>Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetherin+inhibits+retrovirus+release+and+is+antagonized+by+HIV-1+Vpu.">Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu.</a> Nature. 451, 425-430 (2008).</li><li>Nakamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterodimerization+of+the+IL-2+receptor+beta-+and+gamma-chain+cytoplasmic+domains+is+required+for+signalling.">Heterodimerization of the IL-2 receptor beta- and gamma-chain cytoplasmic domains is required for signalling.</a> Nature. 369, 330-333 (1994).</li><li>Wang, X., Rickert, M., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+quaternary+complex+of+interleukin-2+with+its+alpha,+beta,+and+gammac+receptors.">Structure of the quaternary complex of interleukin-2 with its alpha, beta, and gammac receptors.</a> Science. 310, 1159-1163 (2005).</li></ol>

De 10-lags cellefabrikker er en effektiv beholder til fremstilling af milligram-mængder af protein. En væsentlig fordel ved at anvende cellefabrikken i forhold til andre traditionelle beholdere, såsom rulleflasker og rystekolber eller spinnerkolber, er, at de ikke kræver køb af yderligere laboratorieudstyr. En standard CO 2 inkubator (ca. 6,0 cu. Ft) vil nemt rumme fire 10-lags cellefabrikker (fig. 2). Desuden kræver disse fartøjer mindre arbejdskrævende og plads end retter, kolber el...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn reagens </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Alkalisk phosphatase (BCIP / NBT) flydende substratopløsning </td><td> Sigma </td><td> B6404 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiotikum / antimycotikum, 100X </td><td> Invitrogen </td><td> 15240062 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-HA affinitetsmatrix, klon 3F10 </td><td> Roche </td><td> 1815016 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-HA murint mAb, klon 16B12 </td><td> Covance </td><td> MMS-101P </td><td></td></tr><tr><td> Cellekultur kolbe T75 cm2 vævskultur behandlet </td><td> Corning </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> Cellekultur kolbe, T225 cm2 vævskultur behandlet </td><td> Corning </td><td> 431082 </td><td></td></tr><tr><td>Cellekulturplader ,6-brønds vævskulturplade behandlet </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td></td></tr><tr><td> Cell fabrikken, 10-lag CellSTACK </td><td> Corning </td><td> 3312 </td><td></td></tr><tr><td> Centramate Omega 5K Cassette </td><td> Pall </td><td> OS005C12 </td><td></td></tr><tr><td> Centramate Omega 30K kassette </td><td> Pall </td><td> OS030C12 </td><td></td></tr><tr><td> Kromatografi glassøjle, 1.0x10 cm </td><td> Kontes </td><td> 4204001010 </td><td></td></tr><tr><td> Ciprofloxacin </td><td> Sigma </td><td> 17850 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) </td><td> Sigma </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> Føtalt bovint serum (FBS), varmeinaktiveret </td><td> Invitrogen </td><td> 12484-028 </td><td></td></tr><tr><td> FuGENE HD transfektionsreagens </td><td> Promega </td><td> 4709691001 </td><td></td></tr><tr><td> GeneJuice transfektionsreagens </td><td> EMD / Merck </td><td> 70967-6 </td><td></td></tr><tr><td> Glycin </td><td> Sigma </td><td> G8898 </td><td></td></tr><tr><td> Ged anti-mus IgG F (ab &#39;) 2 alkalisk </td><td> Thermo Scientific </td><td> 31324 </td><td></td></tr><tr><td> phosphatase-konjugeret antistof </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hæmagglutinin (HA)-peptid, 100 mg </td><td> Genscript </td><td> brugerdefinerede syntese </td><td></td></tr><tr><td> (Sekvens: YPYDVPDYA, 95% renhed) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> HEK 293T-celler </td><td> ATCC </td><td> CRL-11.268 </td><td></td></tr><tr><td> Household blegemiddel (4% w / v natriumhypochlorit) </td><td> forskellige mærker er til rådighed </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Immobilon-P PVDF-membran </td><td> Millipore </td><td> IPVH07850 </td><td></td></tr><tr><td> Miniprep plasmid Purification Kit, PureLink Quick </td><td> Invitrogen </td><td> K2100-11 </td><td></td></tr><tr><td> MaxiPrep plasmidoprensning kit, PureLink HiPure </td><td> Invitrogen </td><td> K2100-07 </td><td></td></tr><tr><td> NaN3 </td><td> Sigma </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> pDISPLAY ekspressionsvektor </td><td> Invitrogen </td><td> V660-20 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / streptomycin (pen / strep), 100X </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphatpufret saltvand (PBS), steril 1X </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> Polyethylenimin (PEI), lineære 25 kDa </td><td> Polyscience </td><td> 23966 </td><td></td></tr><tr><td> Skummetmælk pulver </td><td> Carnation </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stericup-GP PES vakuumfiltrering enhed, </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 um, 500 ml </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Trypanblåt </td><td> Invitrogen </td><td> 15250061 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin-EDTA, 0,05% (w / v) </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Sigma </td><td> P7949 </td><td></td></tr><tr><td> Valproinsyre </td><td> Sigma </td><td> P4543 </td><td></td></tr><tr><td> Centramate tangential flow-system </td><td> Pall </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CO 2 befugtet inkubator, standard 6,0 cu. ft </td><td> forskellige mærker er til rådighed </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Elektroforese og overførsel enhed </td><td> forskellige mærker er til rådighed </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Inkubator, 37 ° C </td><td> forskellige mærker er til rådighed </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells

Rekombinant protein ekspression i bakterier, typisk E. coli, har været den mest succesfulde strategi for milligram mængde ekspression af proteiner. Imidlertid prokaryote værter er ofte ikke så egnet til ekspression af humane, virale eller eukaryote proteiner på grund af toksicitet af det fremmede makromolekylet, forskelle i proteinfoldning maskinen eller på grund af manglen på bestemte co-eller post-translationelle modifikationer i bakterier. Ekspressionssystemer baseret på gær (P. pastoris eller S. cerevisiae) 1,2, baculovirus-inficerede insektceller (S. frugiperda eller T. ni) celler 3, og cellefri translation in vitro systemer 2,4 succes er blevet anvendt til at producerer mammale proteiner. Intuitivt det bedste match er at anvende en mammal vært til at sikre produktionen af ​​rekombinante proteiner, der indeholder de korrekte post-translationelle modifikationer. Et antal pattedyrscellelinier (Human Embryonic børneney (HEK) 293, er C V-1-celler i O rigin bærer S V40 indikativpris T-antigen (COS), kinesisk hamsterovarie (CHO), og andre) er blevet anvendt med succes til at overudtrykke milligram-mængder af en række humane proteiner 5-9. Imidlertid er fordelene ved at bruge pattedyrceller imødegås ofte med højere omkostninger, krav om specialiseret laboratorieudstyr, lavere protein udbytter, og lange gange for at udvikle stabile udtryk cellelinjer. Øget udbytte og producerer proteiner hurtigere, og samtidig holde omkostningerne nede, er vigtige faktorer for mange akademiske og kommercielle laboratorier. Her beskriver vi en tids-og omkostningseffektiv, todelt fremgangsmåde til ekspression af secernerede humane proteiner fra adhærente HEK 293T-celler. Dette system er i stand til at frembringe mikrogram til milligram-mængder af funktionelt protein for strukturelle, biofysiske og biokemiske undersøgelser. Den første del, multiple konstruktioner af genet af interesse er producered parallelt og forbigående transficeret ind i omliggende HEK-293T celler i lille skala. Påvisning og analyse af rekombinant protein secerneret i cellekulturmediet udføres ved western blot-analyse under anvendelse af kommercielt tilgængelige antistoffer rettet mod en vektor-kodede protein rensnings-taggen. Efterfølgende egnede konstruktioner til proteinproduktion i stor skala produktion transient transficeret med polyethylenimin (PEI) i 10 lag cellefabrikker. Proteiner udskilt i l-volumener af konditioneret medium er koncentreret i håndterbare størrelse ved hjælp af tangentielstrømningsfiltrering, efterfulgt af oprensning af anti-HA-affinitetskromatografi. Anvendeligheden af ​​denne platform påvises ved dets evne til at udtrykke milligram-mængder af cytokiner, cytokin-receptorer, celleoverfladereceptorer, iboende begrænsninger faktorer og virale glycoproteiner. Denne fremgangsmåde blev også med held anvendt i strukturel bestemmelse af de trimere ebolavirus glycoprotein 5,10. <p cpige = &quot;jove_content&quot;&gt; Som konklusion, denne platform tilbyder brugervenlighed, hastighed og skalerbarhed og samtidig maksimere protein kvalitet og funktionalitet. Desuden kræves der ingen yderligere udstyr, undtagen en standard befugtet CO2-inkubator, der kræves. Denne procedure kan hurtigt udvides til systemer med større kompleksitet, såsom co-ekspression af protein-komplekser, antigener og antistoffer, fremstillingen af ​​viruslignende partikler til vacciner, eller produktion af adenovira eller lentivira til transduktion af vanskelige cellelinier.

Watch this Scientific Journal Video about A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells at JoVE.com

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

I den post-humane genom-æraen, er tilgængeligheden af ​​rekombinante proteiner i native konformationer afgørende for strukturel, funktionel og terapeutisk forskning og udvikling. Her beskriver vi en test-og store protein-ekspressionssystem i humane embryoniske nyre 293T-celler, som kan anvendes til fremstilling af en række af rekombinante proteiner.

En bekvem og General Expression Platform for produktion af secernerede proteiner fra humane celler

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Den MultiBac Protein Complex Production Platform på EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Effektiv Agroinfiltration af planter til højt niveau transient ekspression af rekombinante proteiner

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Effektiv Produktion og oprensning af rekombinant murin Kindlin-3 fra Insect Celler til Biofysiske Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grønt fluorescerende protein-baserede Expression Screening membranproteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Berigelse af ekstracellulære matrixproteiner fra væv og fordøjelse til peptider for massespektrometri Analyse

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...