Name: a convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells
Uploaded: 2012-07-31T13:00:00
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Ce travail a été soutenu par un réseau de traitement du VIH de l&#39;Ontario Subvention de fonctionnement de la recherche (GOR-G645) et les Instituts canadiens de recherche en santé Bourse de nouveau chercheur (MSH-113554) pour JEL, et l&#39;Université de Toronto à HA bourses, CAF, et le JDC. Les auteurs tiennent à remercier Marnie Fusco, Dafna Abelson et le Dr Erica Ollmann Saphire à The Scripps Research Institute (La Jolla, CA) pour les cellules fournissant, vecteur d&#39;expression Ebola GP et des conseils généraux.

1. Travail de préparation - Les constructions et les cultures cellulaires Avant de commencer le protocole, le gène d&#39;intérêt devrait être codon-optimisé pour l&#39;expression dans les cellules de mammifères, et cloné dans un vecteur d&#39;expression approprié en utilisant des techniques de biologie moléculaire. Afin d&#39;assurer le plus de chance pour l&#39;expression réussie, de multiples variantes du gène d&#39;intérêt doit être généré. De nombreux vecteurs d&#39;expre...

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	<li>Celik, E., Calik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+proteins+by+yeast+cells.">Production of recombinant proteins by yeast cells.</a> Biotechnol. Adv. , (2011).</li><li>Yokoyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+expression+systems+for+structural+genomics+and+proteomics.">Protein expression systems for structural genomics and proteomics.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 7, 39-43 (2003).</li><li>Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+production+of+proteins+in+insect+and+mammalian+cells+for+structural+biology.">Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology.</a> J. Struct. Biol. 172, 55-65 (2010).</li><li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+Applications+come+of+age.">Cell-free protein synthesis: Applications come of age.</a> Biotechnol. Adv. , (2011).</li><li>Lee, J. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoprotein+structural+genomics:+solving+the+glycosylation+problem.">Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem.</a> Structure. 15, 267-273 (2007).</li><li>Lee, J. E., Fusco, M. H., Saphire, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+platform+for+screening+expression+and+crystallization+of+glycoproteins+produced+in+human+cells.">An efficient platform for screening expression and crystallization of glycoproteins produced in human cells.</a> Nature Protocols. 4, 592-604 (2009).</li><li>Nettleship, J. E., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+production+of+glycoproteins+by+transient+expression+in+Mammalian+cells.">The production of glycoproteins by transient expression in Mammalian cells.</a> Methods Mol. Biol. 498, 245-263 (2009).</li><li>Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. 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Les usines cellulaires 10-couche sont un navire efficace pour la production de quelques milligrammes de protéines. Un avantage majeur de l&#39;utilisation de l&#39;usine cellulaire par rapport aux autres bateaux traditionnels, tels que des bouteilles, flacons roulants secouer ou spinner, c&#39;est qu&#39;ils ne nécessitent pas l&#39;achat de tout équipement de laboratoire supplémentaire. Une norme incubateur à CO 2 (environ 6,0 pi ³) sera facilement accueillir quatre usines cellulaires 10-couche <strong...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Phosphatase alcaline (BCIP / NBT) solution de substrat liquide </td><td> Sigma </td><td> B6404 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiotiques / antifongique, 100X </td><td> Invitrogen </td><td> 15240062 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-HA matrice d&#39;affinité, clone 3F10 </td><td> Roche </td><td> 1815016 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-HA AcM murin, clone 16B12 </td><td> Covance </td><td> MMS-101P </td><td></td></tr><tr><td> Flacon de culture cellulaire, culture de tissus T75 cm 2 traité </td><td> Corning </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> Flacon de culture cellulaire, culture de tissus T225 cm 2 traité </td><td> Corning </td><td> 431082 </td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture cellulaire ,6-bien la culture de tissus traités </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td></td></tr><tr><td> Usine cellulaire, 10-couche CellSTACK </td><td> Corning </td><td> 3312 </td><td></td></tr><tr><td> Centramate Omega 5K cassette </td><td> Voile </td><td> OS005C12 </td><td></td></tr><tr><td> Centramate Omega 30K cassette </td><td> Voile </td><td> OS030C12 </td><td></td></tr><tr><td> Chromatographie Colonne de verre, cm 1,0.10 </td><td> Kontes </td><td> 4204001010 </td><td></td></tr><tr><td> La ciprofloxacine </td><td> Sigma </td><td> 17850 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Eagle modifié par Dulbecco des médias (DMEM) </td><td> Sigma </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal (FBS), inactivé par la chaleur </td><td> Invitrogen </td><td> 12484-028 </td><td></td></tr><tr><td> Réactif de transfection FuGENE HD </td><td> Promega </td><td> 4709691001 </td><td></td></tr><tr><td> Réactif de transfection GeneJuice </td><td> EMD / Merck </td><td> 70967-6 </td><td></td></tr><tr><td> Glycine </td><td> Sigma </td><td> G8898 </td><td></td></tr><tr><td> De chèvre anti-IgG de souris F (ab &#39;) 2 piles alcalines </td><td> Thermo Scientific </td><td> 31324 </td><td></td></tr><tr><td> conjugué à la phosphatase anticorps </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hémagglutinine (HA) peptide, de 100 mg </td><td> GenScript </td><td> de synthèse sur mesure </td><td></td></tr><tr><td> (Séquence: YPYDVPDYA; une pureté de 95%) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cellules HEK 293T </td><td> ATCC </td><td> CRL-11268 </td><td></td></tr><tr><td> Household blanchiment (4% d&#39;hypochlorite de sodium en poids / volume) </td><td> différentes marques sont disponibles </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Immobilon-P membrane de PVDF </td><td> Millipore </td><td> IPVH07850 </td><td></td></tr><tr><td> Kit Miniprep purification de plasmide, Purelink rapide </td><td> Invitrogen </td><td> K2100-11 </td><td></td></tr><tr><td> Kit Maxiprep purification de plasmide, Purelink HiPure </td><td> Invitrogen </td><td> K2100-07 </td><td></td></tr><tr><td> NaN 3 </td><td> Sigma </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> Vecteur d&#39;expression pDISPLAY </td><td> Invitrogen </td><td> V660-20 </td><td></td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine (pénicilline / streptomycine), 100X </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Tampon phosphate salin (PBS), stérile 1X </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> Polyéthylèneimine (PEI), linéaires 25 kDa </td><td> Polyscience </td><td> 23966 </td><td></td></tr><tr><td> Poudre de lait écrémé sec </td><td> Œillet </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stericup-GP unité du PSE filtration sous vide, </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 um, capacité de 500 ml </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Le bleu trypan </td><td> Invitrogen </td><td> 15250061 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine-EDTA, 0,05% (p / v) </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Sigma </td><td> P7949 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;acide valproïque </td><td> Sigma </td><td> P4543 </td><td></td></tr><tr><td> Centramate système à écoulement tangentiel </td><td> Voile </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CO 2 incubateur humidifié, standard 6.0 cu. pi </td><td> différentes marques sont disponibles </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Unité d&#39;électrophorèse et le transfert </td><td> différentes marques sont disponibles </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Incubateur, 37 ° C </td><td> différentes marques sont disponibles </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells

Recombinant expression des protéines dans les bactéries, généralement E. coli, a été la stratégie la plus efficace pour l&#39;expression quantité milligramme de protéines. Cependant, les hôtes procaryotes sont souvent pas aussi appropriée pour l&#39;expression de l&#39;homme, les protéines virales ou eucaryote en raison de la toxicité de la macromolécule étrangère, les différences dans le mécanisme de repliement des protéines, ou en raison de l&#39;absence de modifications co-ou post-traductionnelle particulier chez les bactéries. Des systèmes d&#39;expression basés sur la levure (P. pastoris ou S. cerevisiae) 1,2, infectées par le baculovirus d&#39;insectes (S. frugiperda ou T. ni) des cellules 3 et acellulaire in vitro des systèmes de traduction 2,4 ont été utilisés avec succès pour produire des protéines de mammifères. Intuitivement, la meilleure correspondance est d&#39;utiliser un hôte mammifère afin d&#39;assurer la production de protéines recombinantes qui contiennent les bonnes modifications post-traductionnelles. Un certain nombre de lignées cellulaires de mammifères (Human Embryonic Kidney (HEK) 293, C V-1 des cellules dans O RIGINE portant le S V40 Larget l&#39;antigène T (COS), ovaire de hamster chinois (CHO), et d&#39;autres) ont été utilisées avec succès pour surexprimer milligrammes d&#39;un certain nombre de protéines humaines 5-9. Toutefois, les avantages de l&#39;utilisation des cellules de mammifères sont souvent contrés par des coûts plus élevés, des exigences de l&#39;équipement de laboratoire spécialisé, les rendements en protéines plus faibles et les temps longs pour développer des lignées stables de cellules d&#39;expression. Accroître le rendement et la production des protéines plus rapide, tout en gardant des coûts bas, sont des facteurs importants pour de nombreux laboratoires universitaires et commerciaux. Ici, nous décrivons un temps et le coût-efficace, en deux parties la procédure pour l&#39;expression de protéines sécrétées humaines à partir de cellules HEK adhérentes 293T. Ce système est capable de produire microgramme à quelques milligrammes de protéine fonctionnelle pour des études structurales, biophysiques et biochimiques. La première partie, plusieurs constructions du gène d&#39;intérêt sont de produired en parallèle et transfectées de façon transitoire dans des cellules HEK adhérentes 293T à petite échelle. La détection et l&#39;analyse de la protéine recombinante sécrétée dans le milieu de culture cellulaire est réalisée par analyse western blot en utilisant des anticorps dirigés contre disponibles dans le commerce un tag vecteur protéine codée par la purification. Par la suite, des constructions appropriées pour la production de protéines à grande échelle sont transfectées de façon transitoire à l&#39;aide polyéthylèneimine (PEI) dans les usines de cellules 10-couche. Protéines sécrétées dans les volumes litre de milieu conditionné sont concentrées en un montant gérables en utilisant une filtration à flux tangentiel, suivie d&#39;une purification par chromatographie d&#39;affinité anti-HA. L&#39;utilité de cette plate-forme est prouvé par sa capacité à exprimer quelques milligrammes de cytokines, de récepteurs de cytokines, des récepteurs de surface cellulaire, des facteurs de restriction intrinsèques, et des glycoprotéines virales. Cette méthode a également été utilisé avec succès dans la détermination de la structure des trimères 5,10 glycoprotéine Ebola. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; En conclusion, cette plate-forme offre la facilité d&#39;utilisation, la vitesse et l&#39;évolutivité, tout en maximisant la qualité des protéines et la fonctionnalité. En outre, aucun matériel supplémentaire, autre qu&#39;une norme humidifié incubateur à CO 2, est nécessaire. Cette procédure peut être rapidement étendu à des systèmes de plus grande complexité, comme la co-expression de complexes protéiques, des antigènes et des anticorps, la production de virus-like particules pour les vaccins, ou la production d&#39;adénovirus ou des lentivirus pour la transduction de lignées cellulaires difficiles.

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A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Dans l&#39;ère post-génomique humaine, la disponibilité de protéines recombinantes dans des conformations natives est cruciale pour la recherche structurelle, fonctionnelle et thérapeutique et le développement. Ici, nous décrivons un test et à grande échelle du système expression des protéines dans les cellules embryonnaires humaines de rein 293T qui peuvent être utilisés pour produire une variété de protéines recombinantes.

Une plate-forme d&#39;expression pratique et général pour la production de protéines sécrétées à partir de cellules humaines

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

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