Name: a convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells
Uploaded: 2012-07-31T13:00:00
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Diese Arbeit wurde von einer HIV-Behandlung Ontario Network Research Operating Grant (ROG-G645) und der kanadischen Institutes of Health Research New Investigator Award (MSH-113554) zur JEL, und University of Toronto-Stipendien an HA, FCA, und das JDC unterstützt. Die Autoren bedanken sich Marnie Fusco, Dafna Abelson und Dr. Erica Ollmann Saphire am Scripps Research Institute (La Jolla, CA) danken für die Bereitstellung von Zellen, Ebolavirus GP Expressionsvektor und allgemeine Beratung.

1. Vorbereitung der Arbeit - Konstrukte und Zellkulturen Bevor das Protokoll, sollte das Gen von Interesse für die Expression in Säugerzellen Codon-optimiert und kloniert in einen geeigneten Expressionsvektor unter Verwendung herkömmlicher molekularbiologischer Techniken umfaßt. Um die höchste Wahrscheinlichkeit für eine erfolgreiche Expression zu gewährleisten, sollten mehrere Varianten des Gens von Interesse erzeugt werden. Viele Säugetier-Expressionsvektoren sind im Handel erhältli...

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	<li>Celik, E., Calik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+proteins+by+yeast+cells.">Production of recombinant proteins by yeast cells.</a> Biotechnol. Adv. , (2011).</li><li>Yokoyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+expression+systems+for+structural+genomics+and+proteomics.">Protein expression systems for structural genomics and proteomics.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 7, 39-43 (2003).</li><li>Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. 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Die 10-Schicht Zellfabriken sind eine effektive Behälter für die Herstellung von Milligramm-Mengen des Proteins. Ein wesentlicher Vorteil der Verwendung der Zellfabrik gegenüber anderen traditionellen Schiffe, wie z. B. Rollerflaschen, Schüttelkolben oder Spinnerflaschen, ist, dass sie bedürfen nicht der Kauf eines zusätzlichen Laborgeräte. Ein Standard-CO 2-Inkubator (~ 6,0 cu. Ft.) wird leicht Platz für vier 10-Schicht Zellfabriken (Abb. 2). Darüber hinaus erfordern diese Gefäße ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Die alkalische Phosphatase (BCIP / NBT) flüssiges Substrat-Lösung </td><td> Sigma </td><td> B6404 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiotikum / Antimykotikum, 100X </td><td> Invitrogen </td><td> 15240062 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-HA Affinitätsmatrix, Klon 3F10 </td><td> Roche </td><td> 1815016 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-HA murinen mAk, Klon 16B12 </td><td> Covance </td><td> MMS-101P </td><td></td></tr><tr><td> Zellkulturflasche, behandelt T75 cm 2 Gewebekultur </td><td> Corning </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> Zellkulturflasche, behandelt T225 cm 2 Gewebekultur </td><td> Corning </td><td> 431082 </td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturplatten ,6-Well-Gewebekulturplatten behandelt </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td></td></tr><tr><td> Zellfabrik, 10-Schicht CellSTACK </td><td> Corning </td><td> 3312 </td><td></td></tr><tr><td> Centramate Omega 5K Cassette </td><td> Leichentuch </td><td> OS005C12 </td><td></td></tr><tr><td> Centramate Omega 30K Cassette </td><td> Leichentuch </td><td> OS030C12 </td><td></td></tr><tr><td> Chromatographie-Glassäule, 1.0x10 cm </td><td> Kontes </td><td> 4204001010 </td><td></td></tr><tr><td> Ciprofloxacin </td><td> Sigma </td><td> 17850 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) </td><td> Sigma </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum (FBS), hitze-inaktiviert </td><td> Invitrogen </td><td> 12484-028 </td><td></td></tr><tr><td> FuGENE HD Transfektionsreagenz </td><td> Promega </td><td> 4709691001 </td><td></td></tr><tr><td> GeneJuice Transfektionsreagenz </td><td> EMD / Merck </td><td> 70967-6 </td><td></td></tr><tr><td> Glycine </td><td> Sigma </td><td> G8898 </td><td></td></tr><tr><td> Ziege anti-Maus-IgG F (ab &#39;) 2 alkalischen </td><td> Thermo Scientific </td><td> 31324 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphatase-konjugierten Antikörper </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hämagglutinin (HA)-Peptid, 100 mg </td><td> Genscript </td><td> Custom Synthesis </td><td></td></tr><tr><td> (Sequenz: YPYDVPDYA, 95% Reinheit) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> HEK 293T-Zellen </td><td> ATCC </td><td> CRL-11268 </td><td></td></tr><tr><td> Household Bleichmittel (4% w / v Natriumhypochlorit) </td><td> verschiedenen Marken stehen zur Verfügung </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Immobilon-P PVDF-Membran </td><td> Millipore </td><td> IPVH07850 </td><td></td></tr><tr><td> MiniPrep Plasmid Purification Kit, PureLink Schnellsuche </td><td> Invitrogen </td><td> K2100-11 </td><td></td></tr><tr><td> Maxiprep Plasmid Purification Kit, PureLink HiPure </td><td> Invitrogen </td><td> K2100-07 </td><td></td></tr><tr><td> NaN 3 </td><td> Sigma </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> pDisplay Expressionsvektor </td><td> Invitrogen </td><td> V660-20 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin (Pen / Strep), 100X </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS), sterile 1X </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> Polyethylenimin (PEI), lineares 25 kDa </td><td> Polyscience </td><td> 23966 </td><td></td></tr><tr><td> Magermilch trockenes Pulver </td><td> Nelke </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stericup-GP PES Vakuumfiltrationsgerät, </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 um, 500 ml Fassungsvermögen </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Trypanblau </td><td> Invitrogen </td><td> 15250061 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin-EDTA, 0,05% (w / v) </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Sigma </td><td> P7949 </td><td></td></tr><tr><td> Valproinsäure </td><td> Sigma </td><td> P4543 </td><td></td></tr><tr><td> Centramate Tangentialströmung System </td><td> Leichentuch </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CO 2 befeuchteten Inkubator, Standard 6,0 cu. ft. </td><td> verschiedenen Marken stehen zur Verfügung </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Elektrophorese und Transfer-Einheit </td><td> verschiedenen Marken stehen zur Verfügung </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Inkubator, 37 ° C </td><td> verschiedenen Marken stehen zur Verfügung </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells

Rekombinante Proteinexpression in Bakterien, typischerweise E. coli, war die erfolgreichste Strategie zur Milligramm Menge Expression von Proteinen. Jedoch sind prokaryotische Wirte oft keine Bedeutung für die Expression von Mensch, viralen oder eukaryotischen Proteinen aufgrund der Toxizität der ausländischen Makromolekül, Unterschiede in der Proteinfaltung Maschinen oder aufgrund des Fehlens bestimmter Co-oder post-translationale Modifikationen in Bakterien. Expressionssysteme auf Hefe (P. pastoris oder S. cerevisiae) 1,2, Baculovirus-infizierten Insektenzellen (S. frugiperda oder T. ni) Zellen 3 und zellfreien in vitro-Translation-Systeme basieren 2,4 wurden erfolgreich eingesetzt, um Säugetier-Proteine ​​herzustellen. Intuitiv ist die beste Übereinstimmung mit einem Säugetier-Wirt verwenden, um die Produktion von rekombinanten Proteinen, die die entsprechenden post-translationale Modifikationen beinhalten gewährleisten. Eine Reihe von Säugetier-Zelllinien (Human Embryonic KidNey (HEK) 293, haben C V-1 Zellen in O Rigin tragenden S V40 larget T-Antigen (COS), Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO), und andere) erfolgreich verwendet, um Milligramm-Mengen einer Reihe von humanen Proteine ​​überexprimieren 5-9. Allerdings sind die Vorteile der Verwendung von Säugerzellen oft durch höhere Kosten, Erfordernis von speziellen Laborgeräten, niedriger Protein-Ausbeuten und lange Zeiten auf stabile Expression-Zelllinien zu entwickeln begegnet. Höherer Ertrag und Produktion von Proteinen schneller, während die Kosten niedrig hält, sind die Hauptfaktoren für viele akademische und kommerzielle Labors. Hier beschreiben wir eine zeit-und kosteneffiziente, zweiteiliges Verfahren zur Expression von sezernierten humanen Proteinen aus adhärenten HEK 293T-Zellen. Dieses System ist in der Lage Mikrogramm bis Milligramm-Mengen an funktionellem Protein aus strukturellen, biophysikalischen und biochemischen Studien. Der erste Teil, mehrere Konstrukte des Gens von Interesse zu erzeugend parallel und transient in HEK 293T-Zellen adhärent in kleinem Maßstab transfiziert. Die Detektion und Analyse von rekombinantem Protein in das Zellkulturmedium sekretiert wird durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung kommerziell erhältlicher Antikörper gegen ein Vektor-kodierte Proteinreinigung Tag gerichteten durchgeführt. Anschließend werden geeignete Konstrukte für die großtechnische Produktion Protein transient transfiziert mit Polyethylenimin (PEI) im 10-Schicht Zellfabriken. Proteine ​​in Liter-Volumen von konditioniertem Medium sezerniert werden in handhabbare Mengen unter Verwendung Tangentialflussfiltration, gefolgt von Reinigung durch Anti-HA-Affinitätschromatographie eingeengt. Der Nutzen dieser Plattform wird durch seine Fähigkeit, Milligramm-Mengen von Cytokinen, Cytokinrezeptoren, Zelloberflächenrezeptoren, intrinsische Restriktionsfaktoren und viralen Glykoproteine ​​exprimieren erwiesen. Diese Methode wurde auch erfolgreich bei der Strukturaufklärung der trimeren Ebolavirus Glykoprotein 5,10 verwendet. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Abschließend bietet diese Plattform Benutzerfreundlichkeit, Geschwindigkeit und Skalierbarkeit bei gleichzeitiger Maximierung der Protein Qualität und Funktionalität. Darüber hinaus ist keine zusätzliche Ausrüstung, andere als eine Standard-befeuchteten CO 2-Inkubator, erforderlich. Dieses Verfahren kann schneller auf Systeme mit höherer Komplexität, wie Co-Expression von Protein-Komplexe, Antigenen und Antikörpern, die Produktion von Virus-ähnlichen Partikeln für Impfstoffe oder Herstellung von Adenoviren oder Lentiviren zur Transduktion von schwierigen Zelllinien erweitert werden.

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A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

In der Post-Genom-Ära menschlicher, ist die Verfügbarkeit von rekombinanten Proteinen in nativer Konformation darauf an, strukturelle, funktionelle und therapeutische Forschung und Entwicklung. Hier beschreiben wir ein Test-und Proteomik-Expressionssystem in humanen embryonalen Nierenzellen 293T-Zellen, die verwendet werden, um eine Vielzahl von rekombinanten Proteinen hergestellt werden können.

Eine bequeme und allgemein Expression Plattform für die Produktion von sekretierten Proteinen aus menschlichen Zellen

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Vermehrung von humanen embryonalen Stammzellen (ES-Zellen)

Forschung

Biologie

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Mit dem Gene Pulser MXcell Elektroporation System zur Primary Cells mit hohem Wirkungsgrad zu transfizieren

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Die MultiBac Protein Complex Produktion Platform am EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Effiziente Agroinfiltration von Pflanzen für High-Level-Transient Expression von rekombinanten Proteinen

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Effizienten Herstellung und Reinigung von rekombinantem murinem Kindlin-3 von Insektenzellen für biophysikalische Studien

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Anreicherung von extrazellulären Matrixproteinen aus Gewebe und Verdauung in Peptide für Massenspektrometrie-Analyse

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

High Yield Expression von rekombinanten humanen Proteinen mit der transiente Transfektion von HEK293 Zellen in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...