Name: a convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells
Uploaded: 2012-07-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי HIV רשת אונטריו טיפול מחקר הפעלה גרנט (ROG-G645) וקנדה מכון פרס מחקר לחוקר הבריאות החדש (MSH-113554) כדי JEL, ואוניברסיטת טורונטו מלגות חה, FCA, וג&#39;וינט. המחברים מבקשים להודות מארני Fusco, דפנה אבלסון וד&quot;ר אריקה Ollmann Saphire במכון המחקר סקריפס (La Jolla, CA) עבור תאים המספקים, ebolavirus וקטור GP ביטוי וייעוץ כללי.

1. עבודת ההכנה - בונה בתרביות תאים לפני תחילת הטקס, את הגן של עניין צריך להיות קודון, מותאם במיוחד לידי ביטוי בתאי יונקים, והוא משובטים לתוך וקטור ביטוי הולם באמצעות טכניקות סטנדרטיות ביולוגיה מולקולרית. על מנת להבטיח את הסיכוי הגבו...

<ol>
	<li>Celik, E., Calik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+proteins+by+yeast+cells.">Production of recombinant proteins by yeast cells.</a> Biotechnol. Adv. , (2011).</li><li>Yokoyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+expression+systems+for+structural+genomics+and+proteomics.">Protein expression systems for structural genomics and proteomics.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 7, 39-43 (2003).</li><li>Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+production+of+proteins+in+insect+and+mammalian+cells+for+structural+biology.">Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology.</a> J. Struct. Biol. 172, 55-65 (2010).</li><li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+Applications+come+of+age.">Cell-free protein synthesis: Applications come of age.</a> Biotechnol. Adv. , (2011).</li><li>Lee, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Ebola+virus+glycoprotein+bound+to+an+antibody+from+a+human+survivor.">Structure of the Ebola virus glycoprotein bound to an antibody from a human survivor.</a> Nature. 454, 177-182 (2008).</li><li>Bowden, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+Nipah+and+Hendra+virus+attachment+to+their+cell-surface+receptor+ephrin-B2.">Structural basis of Nipah and Hendra virus attachment to their cell-surface receptor ephrin-B2.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 15, 567-572 (2008).</li><li>Evans, M. J., Hartman, S. L., Wolff, D. W., Rollins, S. A., Squinto, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+expression+of+an+anti-human+C5+chimeric+Fab+utilizing+a+vector+that+replicates+in+COS+and+293+cells.">Rapid expression of an anti-human C5 chimeric Fab utilizing a vector that replicates in COS and 293 cells.</a> J. Immunol. Methods. 184, 123-138 (1995).</li><li>Ye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+protein+expression+in+scalable+CHO+transient+transfection.">High-level protein expression in scalable CHO transient transfection.</a> Biotechnol. Bioeng. 103, 542-551 (2009).</li><li>Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+protein+therapeutics+in+cultivated+mammalian+cells.">Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells.</a> Nat Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).</li><li>Lee, J. E., Fusco, M. H., Hessell, A. J., Burton, D. R., Saphire, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+and+tactics+used+in+determining+the+structure+of+trimeric,+prefusion+Ebola+virus+GP.">Techniques and tactics used in determining the structure of trimeric, prefusion Ebola virus GP.</a> Acta Cryst. 65, 1162-1180 (2009).</li><li>Aricescu, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+expression:+developments+for+structural+proteomics.">Eukaryotic expression: developments for structural proteomics.</a> Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 62, 1114-1124 (2006).</li><li>Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-+and+cost-efficient+system+for+high-level+protein+production+in+mammalian+cells.">A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells.</a> Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. D62, 1243-1250 (2006).</li><li>Chang, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoprotein+structural+genomics:+solving+the+glycosylation+problem.">Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem.</a> Structure. 15, 267-273 (2007).</li><li>Lee, J. E., Fusco, M. H., Saphire, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+platform+for+screening+expression+and+crystallization+of+glycoproteins+produced+in+human+cells.">An efficient platform for screening expression and crystallization of glycoproteins produced in human cells.</a> Nature Protocols. 4, 592-604 (2009).</li><li>Nettleship, J. E., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+production+of+glycoproteins+by+transient+expression+in+Mammalian+cells.">The production of glycoproteins by transient expression in Mammalian cells.</a> Methods Mol. Biol. 498, 245-263 (2009).</li><li>Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetherin+inhibits+retrovirus+release+and+is+antagonized+by+HIV-1+Vpu.">Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu.</a> Nature. 451, 425-430 (2008).</li><li>Nakamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterodimerization+of+the+IL-2+receptor+beta-+and+gamma-chain+cytoplasmic+domains+is+required+for+signalling.">Heterodimerization of the IL-2 receptor beta- and gamma-chain cytoplasmic domains is required for signalling.</a> Nature. 369, 330-333 (1994).</li><li>Wang, X., Rickert, M., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+quaternary+complex+of+interleukin-2+with+its+alpha,+beta,+and+gammac+receptors.">Structure of the quaternary complex of interleukin-2 with its alpha, beta, and gammac receptors.</a> Science. 310, 1159-1163 (2005).</li></ol>

את 10-שכבת מפעלים סלולריים הם כלי יעיל לייצור כמויות מיליגרם של חלבון. היתרון הגדול של שימוש מפעל התא על כלי מסורתיים אחרים, כגון בקבוקים, צלוחיות הרים לוחצים או צלוחיות תיבת הטווח, היא שהם אינם דורשים רכישת ציוד מעבדה נוספת. תקן ה-CO 2 באינקובטור (~~~HEAD=NNS 6.0 מ&quot;ק. מט...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> אלקליין phosphatase (BCIP / NBT) מצע נוזלי פתרון </td><td> סיגמא </td><td> B6404 </td><td></td></tr><tr><td> אנטיביוטיקה / Antimycotic, 100x </td><td> Invitrogen </td><td> 15240062 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-HA זיקה מטריקס, שיבוט 3F10 </td><td> רוש </td><td> 1815016 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-HA Murine MAB, שיבוט 16B12 </td><td> Covance </td><td> MMS-101P </td><td></td></tr><tr><td> תרבות בקבוק נייד, T75 2 ס&quot;מ תרבות רקמות טיפול </td><td> קורנינג </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> תרבות בקבוק נייד, T225 2 ס&quot;מ תרבות רקמות טיפול </td><td> קורנינג </td><td> 431082 </td><td></td></tr><tr><td>תרבות צלחות סלולריים ,6-גם תרביות רקמה טיפול </td><td> קורנינג </td><td> 3516 </td><td></td></tr><tr><td> מפעל נייד, 10-שכבת CellSTACK </td><td> קורנינג </td><td> 3312 </td><td></td></tr><tr><td> Centramate אומגה 5K קלטת </td><td> אריג אבל </td><td> OS005C12 </td><td></td></tr><tr><td> Centramate אומגה 30K קלטת </td><td> אריג אבל </td><td> OS030C12 </td><td></td></tr><tr><td> עמודות כרומטוגרפיה זכוכית, 1.0x10 ס&quot;מ </td><td> Kontes </td><td> 4204001010 </td><td></td></tr><tr><td> ציפרופלוקסאצין </td><td> סיגמא </td><td> 17850 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> שונה Dulbecco של הנשר של התקשורת (DMEM) </td><td> סיגמא </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> בסרום שור עוברית (FBS), חום מומת </td><td> Invitrogen </td><td> 12484-028 </td><td></td></tr><tr><td> FuGENE HD מגיב transfection </td><td> Promega </td><td> 4709691001 </td><td></td></tr><tr><td> GeneJuice מגיב transfection </td><td> EMD / מרק </td><td> 70967-6 </td><td></td></tr><tr><td> גליצין </td><td> סיגמא </td><td> G8898 </td><td></td></tr><tr><td> נגד העכבר עיזים IgG ו &#39;(&quot;א.ב.) 2 אלקליין </td><td> Thermo Scientific </td><td> 31324 </td><td></td></tr><tr><td> phosphatase-מצומדות נוגדן </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hemagglutinin (HA) פפטיד, 100 מ&quot;ג </td><td> Genscript </td><td> אישית סינתזה </td><td></td></tr><tr><td> (רצף: YPYDVPDYA, טוהר 95%) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> HEK 293T תאים </td><td> ATCC </td><td> CRL-11268 </td><td></td></tr><tr><td> Householד אקונומיקה (4% w / v hypochlorite נתרן) </td><td> מותגים שונים זמינים </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Immobilon-P PVDF הממברנה </td><td> Millipore </td><td> IPVH07850 </td><td></td></tr><tr><td> MiniPrep ערכת טיהור פלסמיד, PureLink מהירה </td><td> Invitrogen </td><td> K2100-11 </td><td></td></tr><tr><td> MaxiPrep ערכת טיהור פלסמיד, PureLink HiPure </td><td> Invitrogen </td><td> K2100-07 </td><td></td></tr><tr><td> 3 NaN </td><td> סיגמא </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> הביטוי pDISPLAY וקטור </td><td> Invitrogen </td><td> V660-20 </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין (עט / דלקת), 100x </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> פוספט בופר סליין (PBS), סטרילית 1X </td><td> סיגמא </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> Polyethyleneimine (PEI), ליניארי 25 kDa </td><td> Polyscience </td><td> 23966 </td><td></td></tr><tr><td> אבקת חלב רזה יבש </td><td> צפורן </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stericup-GP ואקום PES סינון יחידה, </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td><td></td></tr><tr><td> 0.22 מיקרומטר, 500 מ&quot;ל קיבולת </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Trypan כחול </td><td> Invitrogen </td><td> 15250061 </td><td></td></tr><tr><td> טריפסין, EDTA, 0.05% (w / v) </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> סיגמא </td><td> P7949 </td><td></td></tr><tr><td> חומצה ולפרואית </td><td> סיגמא </td><td> P4543 </td><td></td></tr><tr><td> Centramate מערכת זרימת משיק </td><td> אריג אבל </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CO 2 באינקובטור humidified, תקן 6.0 מ&quot;ק. מטר </td><td> מותגים שונים זמינים </td><td></td><td></td></tr><tr><td> אלקטרופורזה והעברת היחידה </td><td> מותגים שונים זמינים </td><td></td><td></td></tr><tr><td> החממה, 37 ° C </td><td> מותגים שונים זמינים </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells

רקומביננטי ביטוי החלבון חיידקים, בדרך כלל א &#39; coli, הייתה האסטרטגיה המוצלחת ביותר עבור ביטוי בכמות מיליגרם של חלבונים. עם זאת, המארחים פרוקריוטים הם לעתים קרובות לא בהתאם ביטוי של חלבונים אנושיים, ויראלי או האיקריוטים בשל הרעילות של מקרומולקולה החוץ, ההבדלים מכונות קיפול חלבונים, או בשל חוסר שיתוף שינויים או שלאחר translational מסוימים של חיידקים. מערכות ההבעה על בסיס שמרים (pastoris פ או cerevisiae ס) 1,2, baculovirus-נגוע חרק (ס &#39;frugiperda או ט&#39; ני) 3 תאים, תא ללא במבחנה תרגום מערכות 2,4 שימשו בהצלחה לייצר חלבונים יונקים. באופן אינטואיטיבי, את ההתאמה הטובה ביותר היא להשתמש המארח יונקים על מנת להבטיח את הייצור של חלבונים רקומביננטיים המכילים הנכון לאחר שינויים של תרגום. מספר שורות תאים יונקים (קיד עובריים אנושייםניי (HEK) 293, C-V-1 התאים O rigin הנושאים V40 S larget T-antigen (COS), השחלות אוגר סיני (CHO), ועוד) כבר נוצלו בהצלחה overexpress כמויות מיליגרם של מספר חלבונים אנושיים 5-9. עם זאת, היתרונות של שימוש בתאי יונקים הם לעתים קרובות הגיב עלויות גבוהות יותר, הדרישה של ציוד מעבדה מיוחד, תשואות נמוכות יותר חלבון, ושעות ארוכות לפתח יציבות התא קמטי הבעה. הגדלת התשואה חלבונים לייצר מהר יותר, תוך שמירה על עלויות נמוכות, הם הגורמים העיקריים למעבדות אקדמיים ומסחריים רבים. כאן אנו מתארים זמן ועלות יעיל, חלק 2, הליך לביטוי של חלבונים המופרשים אדם חסיד תאים HEK 293T. מערכת זו הוא מסוגל לייצר מיקרוגרם כמויות מיליגרם של חלבון פונקציונלי ללימודי מבניים, biophysical ו ביוכימי. החלק הראשון, בונה רבות של הגן של עניין הם מייצרים<html> ד במקביל transfected זמני אל חסיד תאים HEK 293T בקנה מידה קטן. זיהוי וניתוח של חלבון רקומביננטי מופרש לתוך המדיום תרבית תאים מבוצע על ידי ניתוח כתם המערבי באמצעות נוגדנים זמינים מסחרית המכוונים נגד תג וקטור המקודד טיהור חלבונים. לאחר מכן, בונה מתאים לייצור בקנה מידה גדול חלבון transfected זמני באמצעות polyethyleneimine (PEI) ב -10 מפעלים שכבת תאים. חלבונים המופרשים לתוך ליטר למוצרי כרכים של המדיום אוויר מרוכזים לתוך כמויות לניהול באמצעות סינון זרימת משיק, ואחריו טיהור ידי כרומטוגרפיה נגד HA זיקה. השירות של פלטפורמה זו היא הוכחה על ידי היכולת שלו לבטא את כמויות מיליגרם של ציטוקינים, קולטנים ציטוקינים, קולטנים בתא השטח, גורמים פנימיים, וכן הגבלה גליקופרוטאינים ויראליים. בשיטה זו השתמשו בהצלחה גם בקביעת המבנה של 5,10 גליקופרוטאין trimeric ebolavirus. ילדה = &quot;jove_content&quot;&gt; לסיכום, פלטפורמה זו מציעה מהירות וקלות שימוש, ויכולת הרחבה תוך מיקסום איכות החלבון ופונקציונליות. יתר על כן, הציוד ללא תוספת, למעט תקן humidified CO 2 באינקובטור, נדרשת. הליך זה עשוי להתרחב במהירות למערכות מורכבות יותר, כמו ביטוי משותף של קומפלקסים חלבונים, אנטיגנים ונוגדנים, ייצור של וירוסים כמו חלקיקים עבור חיסונים, או לייצור של adenoviruses או lentiviruses עבור התמרה של שורות תאים קשים.

Watch this Scientific Journal Video about A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells at JoVE.com

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

בעידן שאחרי האדם הגנומיקה, הזמינות של חלבונים רקומביננטיים של תצורות המקומיים הוא חיוני למחקר מבנית, תפקודית טיפולית ופיתוח. כאן אנו מתארים מבחן רחב היקף של ביטוי חלבונים מערכת עובריים אנושיים לתאי כליה 293T, שניתן להשתמש בהם כדי לייצר מגוון של חלבונים רקומביננטיים.

פלטפורמת ביטוי נוח כללי לייצור חלבונים המופרשים מ תאים אנושיים

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

רביה של האדם גזע עובריים (ES) תאים

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

שימוש ג&#39;ין Pulser מערכת MXcell electroporation כדי Transfect תאים ראשוניים עם יעילות גבוהה

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

פלטפורמת הפקת MultiBac החלבון המורכבת בEMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Agroinfiltration היעילה של צמחים לביטוי חולף ברמה גבוהה של חלבונים רקומביננטי

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

הפקה וטיהור יעילה של רקומביננטי Murine Kindlin-3 מתאי חרקים לBiophysical לימודים

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

העשרה תאית מטריקס חלבונים מרקמות ועיכול לפפטידים לניתוח ספקטרומטריית המסה

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

ביטוי תשואה גבוהה של חלבונים אנושיים רקומביננטי עם transfection חולף של תאי HEK293 בהשעיה

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...