Name: a convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells
Uploaded: 2012-07-31T13:00:00
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이 작품은 HA, FCA, 그리고 JDC에 온타리오 에이즈 치료 네트워크 연구 운영 그랜트 (로저-G645) 및 보건 연구 새로운 탐정 수상 (MSH-113554)의 캐나다 연구소 JEL까지, 토론토 장학금의 대학에 의해 지원되었다. 저자 제공 세포, ebolavirus GP의 발현 벡터 및 일반 조언 스크립스 연구소 (라 Jolla, CA)에서 마니 Fusco, Dafna 아벨 박사 에리카 Ollmann Saphire 감사드립니다.

1. 준비 작업 - 구조 및 세포 배양 프로토콜을 시작하기 전에, 관심있는 유전자는 포유 동물 세포의 표현을 위해 코돈 - 최적화 및 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 적절한 발현 벡터에 복제해야합니다. 성공적인 표현을위한 최고의 기회를 보장하기 위해, 관심있는 유전자의 여러 변종이 생성되어야합니다. 많은 포유류의 표현 벡터 상용 가능하며 다양한 정화 태그 (polyhistidin...

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	<li>Celik, E., Calik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+proteins+by+yeast+cells.">Production of recombinant proteins by yeast cells.</a> Biotechnol. Adv. , (2011).</li><li>Yokoyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+expression+systems+for+structural+genomics+and+proteomics.">Protein expression systems for structural genomics and proteomics.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 7, 39-43 (2003).</li><li>Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoprotein+structural+genomics:+solving+the+glycosylation+problem.">Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem.</a> Structure. 15, 267-273 (2007).</li><li>Lee, J. E., Fusco, M. H., Saphire, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+platform+for+screening+expression+and+crystallization+of+glycoproteins+produced+in+human+cells.">An efficient platform for screening expression and crystallization of glycoproteins produced in human cells.</a> Nature Protocols. 4, 592-604 (2009).</li><li>Nettleship, J. E., Rahman-Huq, N., Owens, R. 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10 층 전지 공장 단백질 밀리그램 양의 생산을위한 효과적인 선박입니다. 이러한 롤러 병, 흔들 flasks 또는 회전자 flasks 같은 다른 전통적인 혈관, 이상 세포 공장 사용의 가장 큰 장점은 추가적인 실험실 장비의 구입을 요구하지 않는다는 것입니다. 표준 CO 2 배양기는 (~ 6.0 세제곱. 피트) 쉽게 사 10 층 전지 공장 (그림 2)를 수용합니다. 또한, 이러한 혈관 요리 flasks 또는 세포와 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 알칼리 인산 분해 효소 (BCIP / NBT) 액체 기판 솔루션 </td><td> 시그마 </td><td> B6404 </td><td></td></tr><tr><td> Antimycotic / 항생제, 100X </td><td> Invitrogen </td><td> 15240062 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 HA 친화력 매트릭스, 클론 3F10 </td><td> 로슈 </td><td> 1,815,016 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 HA murine mAb, 클론 16B12 </td><td> Covance </td><td> MMS-101P </td><td></td></tr><tr><td> 세포 배양 플라스크는 T75 cm이 조직 문화는 치료 </td><td> 코닝 </td><td> 430,641 </td><td></td></tr><tr><td> 세포 배양 플라스크는 T225 cm이 조직 문화는 치료 </td><td> 코닝 </td><td> 431,082 </td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 접시는, 6 잘 조직 문화 처리 </td><td> 코닝 </td><td> 3516 </td><td></td></tr><tr><td> 세포 공장, 10 층 CellSTACK </td><td> 코닝 </td><td> 3312 </td><td></td></tr><tr><td> Centramate 오메가 5K 카세트 </td><td> 물리다 </td><td> OS005C12 </td><td></td></tr><tr><td> Centramate 오메가 30K 카세트 </td><td> 물리다 </td><td> OS030C12 </td><td></td></tr><tr><td> 크로마 토그래피 유리 칼럼, 1.0x10 cm </td><td> Kontes </td><td> 4204001010 </td><td></td></tr><tr><td> * 시프 로플 록 사신 </td><td> 시그마 </td><td> 17,850 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco의 수정된 독수리의 미디어 (DMEM) </td><td> 시그마 </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 (FBS), inactivated 열 </td><td> Invitrogen </td><td> 일2484-028 </td><td></td></tr><tr><td> FuGENE의 HD transfection 시약 </td><td> Promega </td><td> 4709691001 </td><td></td></tr><tr><td> GeneJuice의 transfection 시약 </td><td> EMD / 머크 </td><td> 70967-6 </td><td></td></tr><tr><td> 글리신 </td><td> 시그마 </td><td> G8898 </td><td></td></tr><tr><td> 알칼리 염소 안티 - 마우스 IgG F (AB &#39;) 2 </td><td> 써모 과학 </td><td> 31,324 </td><td></td></tr><tr><td> 인산 가수 분해 효소 - 복합 항체 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 적혈구응집소 (HA) 펩타이드, 100 밀리그램 </td><td> Genscript </td><td> 맞춤형 합성 </td><td></td></tr><tr><td> (순서 : YPYDVPDYA, 95 % 순도) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> HEK 293T 세포 </td><td> ATCC </td><td> CRL-11268 </td><td></td></tr><tr><td> HouseholD 표백제 (4 % W / V 나트륨 차아 염소 산염) </td><td> 다양한 브랜드가 있습니다 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Immobilon-P PVDF 멤브레인 </td><td> Millipore </td><td> IPVH07850 </td><td></td></tr><tr><td> MiniPrep 플라스미드 정제 키트, PureLink 빠른 </td><td> Invitrogen </td><td> K2100-11 </td><td></td></tr><tr><td> MaxiPrep 플라스미드 정제 키트, PureLink HiPure </td><td> Invitrogen </td><td> K2100-07 </td><td></td></tr><tr><td> 난이 3 </td><td> 시그마 </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> pDISPLAY의 발현 벡터 </td><td> Invitrogen </td><td> V660-20 </td><td></td></tr><tr><td> 100X 페니실린은 / 스트렙토 마이신 (펜 / strep) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> 인산 버퍼 식염수 (PBS), 무균 1X </td><td> 시그마 </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> Polyethyleneimine (PEI), 선형 25 kDa </td><td> Polyscience </td><td> 23,966 </td><td></td></tr><tr><td> 우유 건조 분말 탈지 </td><td> 카네이션 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stericup-GP PES 진공 여과 장치, </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td><td></td></tr><tr><td> 0.22 μm의, 500 ML 용량 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Trypan 블루 </td><td> Invitrogen </td><td> 15250061 </td><td></td></tr><tr><td> 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.05 % (W / V) </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> 십대 초반-20 </td><td> 시그마 </td><td> P7949 </td><td></td></tr><tr><td> Valproic 산성 </td><td> 시그마 </td><td> P4543 </td><td></td></tr><tr><td> 접선 흐름 시스템을 Centramate </td><td> 물리다 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CO 2 humidified 인큐베이터, 표준 6.0 세제곱. 피트 </td><td> 다양한 브랜드가 있습니다 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 전기 및 전송 장치 </td><td> 다양한 브랜드가 있습니다 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 보육, 37 ° C </td><td> 다양한 브랜드가 있습니다 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells

세균에서 재조합 단백질 발현, 일반적으로 E. 대장균은 단백질의 밀리그램 수량 표현을위한 가장 성공적인 전략이었습니다. 그러나, prokaryotic 호스트는 종종 박테리아 특히 공동 또는 사후 translational 수정의 부족으로 인해 인간, 바이러스성 또는 진핵세포 외국 macromolecule의 독성으로 인해 단백질, 단백질 폴딩 기계의 차이, 또는 표현에 따라 않습니다. 효모 (P.의 pastoris 혹은 S. cerevisiae의) 1,2, baculovirus에 감염된 곤충 (S. frugiperda 또는 T. NI) 셀 3, 체외 번역 시스템의 셀 - 무료를 기반으로 표현 시스템은 2,4가 성공적으로 사용되었습니다 포유 동물 단백질을 생산하고 있습니다. 직관적으로, 최고의 경기는 적절한 사후 translational 개조를 포함하는 재조합 단백질의 생산을 보장하기 위해 포유류의 호스트를 사용하는 것입니다. 포유 동물 세포 라인 (인간 배아 키즈의 숫자네이 (HEK) 293은 S V40 larget T-항원 (COS), 중국 햄스터 난소 (CHO), 그리고 다른 사람을 운반 O rigin에서 C V-1 세포)가 성공적으로 인간 단백질 개수 밀리그램 수량 overexpress 위해 활용되었습니다 5-9. 그러나 포유 동물 세포를 사용의 이점은 주로 안정적인 표현 세포 라인을 개발하기 위해 높은 비용, 전문 실험실 장비의 요구 사항, 낮은 단백질 수율, 그리고 긴 시간으로 반박하고 있습니다. 적은 비용을 유지하면서, 빠른 수율 및 생산 단백질의 증가, 많은 학술 및 상업 실험실을위한 주요 요소입니다. 여기서는 시간과 점착 성의 HEK 293T 세포에서 분비 인간 단백질의 표현을위한 비용 효율적인 두 부분으로 절차를 설명합니다. 이 시스템은 구조적 biophysical 및 생화 학적 연구를위한 기능성 단백질의 밀리그램 수량에 마이크로 그램 제작이 가능합니다. 첫 번째 부분은 관심있는 유전자의 여러 구조는 생산이다병렬 및 transiently 작은 규모의 점착 성의 HEK 293T 세포로 transfected에서 D. 세포 배양 배지로 분비 재조합 단백질의 검출 및 분석은 벡터 인코딩된 단백질 정제 태그 향한 상용화된 항체를 사용하여 서양 얼룩 분석에 의해 수행됩니다. 그 후, 대규모 단백질 생산에 적합한 구조는 transiently 10 층 전지 공장에서 polyethyleneimine (PEI)를 사용 transfected 있습니다. 에어컨 매체의 리터 - 볼륨으로 분비 단백질은 안티 - HA 친화성 크로마 토그래피에 의해 정제 다음에 접선 유동 여과를 사용하여 관리 가능한 금액으로 집중되고있다. 이 플랫폼의 유틸리티는 크린 시토킨, 시토킨 수용체, 세포 표면 수용체, 본질적인 제한 요인과 바이러스 glycoproteins의 밀리그램 수량을 표현하는 기능에 의해 입증된다. 이 방법은 또한 성공적으로 trimeric ebolavirus의 당단백질의 5,10의 구조 결정에 사용되었다. 2 배양기 이외의 추가적인 장비는, 필요하지 않습니다. 이 절차는 신속하게 이러한 단백질 단지, 항원과 항체, 백신 생산을위한 바이러스 같은 입자, 또는 어려운 셀 라인 도입에 대해 adenoviruses 또는 lentiviruses 생산의 공동 표현과 같은 큰 복잡한 체제를 지원하기 위해 확장할 수 있습니다.

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A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

이후 인간 게놈 시대에 원시 conformations에서 재조합 단백질의 가용성은 구조적 기능적 및 치료 연구와 개발에 매우​​ 중요합니다. 여기서는 테스트 및 재조합 단백질의 다양한 생산하는 데 사용할 수있는 인간의 배아 신장 293T 세포에 대규모 단백질 발현 시스템을 설명합니다.

인간의 세포에서 분비 단백질의 생산을위한 편리하고 일반적인 표현 플랫폼

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