Name: a convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells
Uploaded: 2012-07-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por un Ontario Tratamiento del VIH operativo de red Beca de Investigación (ROG-G645) y los Institutos Canadienses de Salud Investigator Award Nueva investigación (MSH-113554) de JEL, y la Universidad de Toronto Becas a la HA, la FCA, y JDC. Los autores desean agradecer a Marnie Fusco, Abelson Dafna y la Dra. Erica Saphire Ollmann en el Instituto de Investigación Scripps (La Jolla, CA) para las células que proporcionan, los virus Ébola vector de expresión GP y asesoramiento general.

1. Preparación del trabajo - Construcciones y Cultivos Celulares Antes de iniciar el protocolo, el gen de interés debe ser codón optimizado para la expresión en células de mamíferos, y se clonó en un vector de expresión apropiado utilizando técnicas estándar de biología molecular. Con el fin de asegurar la máxima probabilidad de éxito para la expresión, múltiples variantes del gen de interés se deben generar. Muchos vectores de expresión de mamíferos están disponibles comerc...

<ol>
	<li>Celik, E., Calik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+proteins+by+yeast+cells.">Production of recombinant proteins by yeast cells.</a> Biotechnol. Adv. , (2011).</li><li>Yokoyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+expression+systems+for+structural+genomics+and+proteomics.">Protein expression systems for structural genomics and proteomics.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 7, 39-43 (2003).</li><li>Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+production+of+proteins+in+insect+and+mammalian+cells+for+structural+biology.">Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology.</a> J. Struct. Biol. 172, 55-65 (2010).</li><li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+Applications+come+of+age.">Cell-free protein synthesis: Applications come of age.</a> Biotechnol. Adv. , (2011).</li><li>Lee, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Ebola+virus+glycoprotein+bound+to+an+antibody+from+a+human+survivor.">Structure of the Ebola virus glycoprotein bound to an antibody from a human survivor.</a> Nature. 454, 177-182 (2008).</li><li>Bowden, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+Nipah+and+Hendra+virus+attachment+to+their+cell-surface+receptor+ephrin-B2.">Structural basis of Nipah and Hendra virus attachment to their cell-surface receptor ephrin-B2.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 15, 567-572 (2008).</li><li>Evans, M. J., Hartman, S. L., Wolff, D. W., Rollins, S. A., Squinto, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+expression+of+an+anti-human+C5+chimeric+Fab+utilizing+a+vector+that+replicates+in+COS+and+293+cells.">Rapid expression of an anti-human C5 chimeric Fab utilizing a vector that replicates in COS and 293 cells.</a> J. Immunol. Methods. 184, 123-138 (1995).</li><li>Ye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+protein+expression+in+scalable+CHO+transient+transfection.">High-level protein expression in scalable CHO transient transfection.</a> Biotechnol. Bioeng. 103, 542-551 (2009).</li><li>Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+protein+therapeutics+in+cultivated+mammalian+cells.">Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells.</a> Nat Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).</li><li>Lee, J. E., Fusco, M. H., Hessell, A. J., Burton, D. R., Saphire, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+and+tactics+used+in+determining+the+structure+of+trimeric,+prefusion+Ebola+virus+GP.">Techniques and tactics used in determining the structure of trimeric, prefusion Ebola virus GP.</a> Acta Cryst. 65, 1162-1180 (2009).</li><li>Aricescu, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+expression:+developments+for+structural+proteomics.">Eukaryotic expression: developments for structural proteomics.</a> Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 62, 1114-1124 (2006).</li><li>Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-+and+cost-efficient+system+for+high-level+protein+production+in+mammalian+cells.">A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells.</a> Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. D62, 1243-1250 (2006).</li><li>Chang, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoprotein+structural+genomics:+solving+the+glycosylation+problem.">Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem.</a> Structure. 15, 267-273 (2007).</li><li>Lee, J. E., Fusco, M. H., Saphire, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+platform+for+screening+expression+and+crystallization+of+glycoproteins+produced+in+human+cells.">An efficient platform for screening expression and crystallization of glycoproteins produced in human cells.</a> Nature Protocols. 4, 592-604 (2009).</li><li>Nettleship, J. E., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+production+of+glycoproteins+by+transient+expression+in+Mammalian+cells.">The production of glycoproteins by transient expression in Mammalian cells.</a> Methods Mol. Biol. 498, 245-263 (2009).</li><li>Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetherin+inhibits+retrovirus+release+and+is+antagonized+by+HIV-1+Vpu.">Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu.</a> Nature. 451, 425-430 (2008).</li><li>Nakamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterodimerization+of+the+IL-2+receptor+beta-+and+gamma-chain+cytoplasmic+domains+is+required+for+signalling.">Heterodimerization of the IL-2 receptor beta- and gamma-chain cytoplasmic domains is required for signalling.</a> Nature. 369, 330-333 (1994).</li><li>Wang, X., Rickert, M., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+quaternary+complex+of+interleukin-2+with+its+alpha,+beta,+and+gammac+receptors.">Structure of the quaternary complex of interleukin-2 with its alpha, beta, and gammac receptors.</a> Science. 310, 1159-1163 (2005).</li></ol>

Las fábricas de células 10-capa son un buque eficaz para la producción de cantidades de miligramos de proteína. Una ventaja importante del uso de la fábrica de células sobre otras embarcaciones tradicionales, tales como botellas de rodillos, matraces de agitación o spinner frascos, es que no requieren la compra de cualquier equipo de laboratorio adicional. Un estándar de incubadora de CO 2 (aproximadamente 6.0 pies cúbicos) fácilmente acomodar a cuatro capas de 10 fábricas de células (Fig....

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> La fosfatasa alcalina (BCIP / NBT) solución de sustrato líquido </td><td> Sigma </td><td> B6404 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiótico / antimicótico, 100X </td><td> Invitrogen </td><td> 15240062 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-HA matriz de afinidad, el clon 3F10 </td><td> Roche </td><td> 1815016 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-HA AcM murino, el clon 16B12 </td><td> Covance </td><td> MMS-101P </td><td></td></tr><tr><td> Frasco de cultivo celular, T75 cm 2 de cultivo de tejidos tratados </td><td> Corning </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> Frasco de cultivo celular, T225 de 2 cm de cultivo de tejidos tratados </td><td> Corning </td><td> 431082 </td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular ,6-de cultivo de tejidos tratados </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td></td></tr><tr><td> Fábrica de la célula, de 10 capas CellSTACK </td><td> Corning </td><td> 3312 </td><td></td></tr><tr><td> Centramate Omega 5K cassette </td><td> Palio </td><td> OS005C12 </td><td></td></tr><tr><td> Centramate Omega 30K cassette </td><td> Palio </td><td> OS030C12 </td><td></td></tr><tr><td> Cromatografía en columna de vidrio, 1.0x10 cm </td><td> Kontes </td><td> 4204001010 </td><td></td></tr><tr><td> Ciprofloxacino </td><td> Sigma </td><td> 17850 </td><td></td></tr><tr><td> De CO 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco modificado de Eagle medio (DMEM) </td><td> Sigma </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> Suero fetal bovino (FBS), inactivado por calor </td><td> Invitrogen </td><td> 12484-028 </td><td></td></tr><tr><td> FuGENE HD reactivo de transfección </td><td> Promega </td><td> 4709691001 </td><td></td></tr><tr><td> GeneJuice reactivo de transfección </td><td> EMD / Merck </td><td> 70967-6 </td><td></td></tr><tr><td> Glicina </td><td> Sigma </td><td> G8898 </td><td></td></tr><tr><td> Cabra anti-ratón IgG F (ab &#39;) 2 alcalina </td><td> Thermo Scientific </td><td> 31324 </td><td></td></tr><tr><td> anticuerpo conjugado con fosfatasa </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> La hemaglutinina (HA) péptido, 100 mg </td><td> Genscript </td><td> síntesis de la costumbre </td><td></td></tr><tr><td> (Secuencia: YPYDVPDYA, y el 95% de pureza) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> HEK 293T </td><td> ATCC </td><td> CRL-11268 </td><td></td></tr><tr><td> Household cloro (4% w / v hipoclorito de sodio) </td><td> varias marcas de fábrica están disponibles </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Immobilon-P membrana PVDF </td><td> Millipore </td><td> IPVH07850 </td><td></td></tr><tr><td> MiniPrep kit de purificación de plásmido, PureLink rápida </td><td> Invitrogen </td><td> K2100-11 </td><td></td></tr><tr><td> Maxiprep kit de purificación de plásmido, PureLink HiPure </td><td> Invitrogen </td><td> K2100-07 </td><td></td></tr><tr><td> NaN 3 </td><td> Sigma </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> pDISPLAY vector de expresión </td><td> Invitrogen </td><td> V660-20 </td><td></td></tr><tr><td> La penicilina / estreptomicina (penicilina / estreptomicina), 100X </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Tampón fosfato salino (PBS) estéril 1X </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> Polietilenimina (PEI), lineales 25 kDa </td><td> Polyscience </td><td> 23966 </td><td></td></tr><tr><td> Leche descremada en polvo en seco </td><td> Clavel </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stericup-GP de vacío PSE unidad de filtración, </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 mm, 500 ml de capacidad </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> El azul tripán </td><td> Invitrogen </td><td> 15250061 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA, 0,05% (w / v) </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20 al </td><td> Sigma </td><td> P7949 </td><td></td></tr><tr><td> El ácido valproico </td><td> Sigma </td><td> P4543 </td><td></td></tr><tr><td> Centramate sistema de flujo tangencial </td><td> Palio </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CO 2 humidificado incubadora, 6.0 pies cúbicos estándar. pie </td><td> varias marcas de fábrica están disponibles </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Electroforesis y transferencia de la unidad </td><td> varias marcas de fábrica están disponibles </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Incubadora, 37 ° C </td><td> varias marcas de fábrica están disponibles </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells

Expresión de proteínas recombinantes en bacterias, típicamente E. coli, ha sido la estrategia de mayor éxito para la expresión cantidad miligramo de proteínas. Sin embargo, huéspedes procariotas son a menudo no es tan adecuado para la expresión de proteínas humanas, virales o eucarióticos, debido a la toxicidad de la macromolécula exterior, las diferencias en la maquinaria plegamiento de proteínas, o debido a la falta de modificaciones particulares co-o post-traslacional en bacterias. Los sistemas de expresión basados ​​en levadura (P. pastoris o S. cerevisiae) 1,2, baculovirus infectado insecto (S. frugiperda o T. ni) las células 3, y libre de células in vitro en los sistemas de traducción 2,4 han sido utilizados con éxito para producir proteínas de mamíferos. Intuitivamente, la mejor coincidencia es utilizar un huésped mamífero para asegurar la producción de proteínas recombinantes que contengan las adecuadas modificaciones post-traduccionales. Un número de líneas de células de mamíferos (Kid embriónico humanoney (HEK) 293, C V-1 en células O RIGEN que transportan el S V40 Larget antígeno T (COS), de ovario de hámster chino (CHO), y otros) se han utilizado con éxito para sobreexpresar cantidades de miligramos de un número de proteínas humanas 5-9. Sin embargo, las ventajas de utilizar células de mamífero son a menudo contrarrestada por mayores costos, requisito de equipo de laboratorio especializado, menores rendimientos de proteínas, y los tiempos prolongados para desarrollar líneas celulares estables de expresión. El aumento de rendimiento y las proteínas que producen más rápido, mientras mantiene los costos bajos, son factores importantes para muchos laboratorios académicos y comerciales. A continuación, describimos un tiempo-y costo-eficiente, procedimiento en dos partes para la expresión de proteínas secretadas por las células humanas de adherentes HEK 293T. Este sistema es capaz de producir microgramos de cantidades de miligramos de proteína funcional para estudios estructurales, biofísicos y bioquímicos. La primera parte, las construcciones de múltiples del gen de interés son producird en paralelo y transfectadas transitoriamente en células HEK 293T adherentes en pequeña escala. La detección y el análisis de la proteína recombinante secretada en el medio de cultivo celular se lleva a cabo mediante análisis Western blot utilizando anticuerpos disponibles comercialmente dirigidos contra una proteína etiqueta vector codificado purificación. Posteriormente, las construcciones adecuadas para la producción de proteínas en gran escala son transfectadas transitoriamente utilizando polietilenimina (PEI) en fábricas de células 10-capa. Las proteínas secretadas en litros volúmenes de medio condicionado se concentran en cantidades manejables utilizando filtración de flujo tangencial, seguido de purificación por cromatografía de afinidad anti-HA. La utilidad de esta plataforma se demuestra por su capacidad para expresar cantidades de miligramos de citoquinas, receptores de citoquinas, receptores de la superficie celular, factores intrínsecos de restricción, y glicoproteínas virales. Este método también fue utilizado con éxito en la determinación estructural de los inhibidores de la glucoproteína 5,10 triméricas virus Ébola. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; En conclusión, esta plataforma ofrece la facilidad de uso, velocidad y escalabilidad, además de maximizar la calidad de la proteína y la funcionalidad. Por otra parte, ningún equipo adicional, que no sea de humidificado incubadora de CO 2, se requiere. Este procedimiento puede ser expandido rápidamente a los sistemas de mayor complejidad, tales como co-expresión de los complejos de proteínas, antígenos y anticuerpos, la producción de partículas similares a virus de vacunas, o la producción de adenovirus o lentivirus para la transducción de líneas celulares difíciles.

Watch this Scientific Journal Video about A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells at JoVE.com

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

En la era genómica post-humana, la disponibilidad de proteínas recombinantes en conformaciones nativas es crucial para la investigación estructural, funcional y terapéutico y el desarrollo. Aquí se describe una prueba a gran escala y sistema de expresión de proteínas en células embrionarias humanas de riñón 293T que se pueden utilizar para producir una variedad de proteínas recombinantes.

Una expresión adecuada y el general de la Plataforma para la producción de proteínas secretadas por las células humanas

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Propagación de la madre embrionarias humanas (ES) Células

Investigación

Biología

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

La preparación de cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina por electroporación

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Utilizando el sistema de electroporación Gene Emisores MXcell para transfectar células primarias con alta eficiencia

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

El Protein Complex Plataforma de Producción MultiBac en el EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Agroinfiltration eficiente de las plantas para la expresión transitoria de alto nivel de proteínas recombinantes

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Producción eficiente y purificación de recombinante murino kindlin-3 a partir de células de insecto para estudios biofísicos

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Fluorescente verde a base de proteína Expresión Proyección de proteínas de membrana en<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Enriquecimiento de la Matriz Extracelular Las proteínas de los tejidos y la digestión en péptidos para el análisis de espectrometría de masas

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

High Yield La expresión de proteínas recombinantes humanos con la transfección transitoria de células HEK293 en Suspensión

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...