Name: a convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells
Uploaded: 2012-07-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells at JoVE.com

Bu çalışma HA, FCA ve JDC bir Ontario HIV Tedavi Araştırma Ağı İşletim Grant (ROG-G645) ve Sağlık Araştırması Yeni Araştırmacı Ödülü (MSH-113.554) Kanada Enstitüleri JEL, ve Toronto Bursu Üniversitesi tarafından desteklenmiştir. Yazarlar sağlayan hücreler, ebolavirus GP ekspresyon vektörü ve genel danışma için Scripps Araştırma Enstitüsü (La Jolla, CA) Marnie Fusco, Dafna Abelson ve Dr Erica Ollmann Saphire teşekkür etmek istiyorum.

1. Hazırlık Çalışması - Oluşumlar ve Hücre Kültürleri Protokolü başlamadan önce, ilgi genindeki memeli hücrelerinde ifadesi için kodon optimize edilmiş, ve standart moleküler biyoloji teknikleriyle uygun bir ifade vektörünün içine klonlandı olmalıdır. Başarılı ifadesi için yüksek şansı sağlamak amacıyla, ilgi genindeki çeşitli türevleri elde edilmelidir. Birçok memeli ifade vektörleri, ticari olarak mevcuttur ve çeşitli saflaştırma etiketler (polyhisti...

<ol>
	<li>Celik, E., Calik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+proteins+by+yeast+cells.">Production of recombinant proteins by yeast cells.</a> Biotechnol. Adv. , (2011).</li><li>Yokoyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+expression+systems+for+structural+genomics+and+proteomics.">Protein expression systems for structural genomics and proteomics.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 7, 39-43 (2003).</li><li>Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+production+of+proteins+in+insect+and+mammalian+cells+for+structural+biology.">Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology.</a> J. Struct. Biol. 172, 55-65 (2010).</li><li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+Applications+come+of+age.">Cell-free protein synthesis: Applications come of age.</a> Biotechnol. Adv. , (2011).</li><li>Lee, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Ebola+virus+glycoprotein+bound+to+an+antibody+from+a+human+survivor.">Structure of the Ebola virus glycoprotein bound to an antibody from a human survivor.</a> Nature. 454, 177-182 (2008).</li><li>Bowden, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+Nipah+and+Hendra+virus+attachment+to+their+cell-surface+receptor+ephrin-B2.">Structural basis of Nipah and Hendra virus attachment to their cell-surface receptor ephrin-B2.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 15, 567-572 (2008).</li><li>Evans, M. J., Hartman, S. L., Wolff, D. W., Rollins, S. A., Squinto, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+expression+of+an+anti-human+C5+chimeric+Fab+utilizing+a+vector+that+replicates+in+COS+and+293+cells.">Rapid expression of an anti-human C5 chimeric Fab utilizing a vector that replicates in COS and 293 cells.</a> J. Immunol. Methods. 184, 123-138 (1995).</li><li>Ye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+protein+expression+in+scalable+CHO+transient+transfection.">High-level protein expression in scalable CHO transient transfection.</a> Biotechnol. Bioeng. 103, 542-551 (2009).</li><li>Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+protein+therapeutics+in+cultivated+mammalian+cells.">Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells.</a> Nat Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).</li><li>Lee, J. E., Fusco, M. H., Hessell, A. J., Burton, D. R., Saphire, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+and+tactics+used+in+determining+the+structure+of+trimeric,+prefusion+Ebola+virus+GP.">Techniques and tactics used in determining the structure of trimeric, prefusion Ebola virus GP.</a> Acta Cryst. 65, 1162-1180 (2009).</li><li>Aricescu, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+expression:+developments+for+structural+proteomics.">Eukaryotic expression: developments for structural proteomics.</a> Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 62, 1114-1124 (2006).</li><li>Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-+and+cost-efficient+system+for+high-level+protein+production+in+mammalian+cells.">A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells.</a> Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. D62, 1243-1250 (2006).</li><li>Chang, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoprotein+structural+genomics:+solving+the+glycosylation+problem.">Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem.</a> Structure. 15, 267-273 (2007).</li><li>Lee, J. E., Fusco, M. H., Saphire, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+platform+for+screening+expression+and+crystallization+of+glycoproteins+produced+in+human+cells.">An efficient platform for screening expression and crystallization of glycoproteins produced in human cells.</a> Nature Protocols. 4, 592-604 (2009).</li><li>Nettleship, J. E., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+production+of+glycoproteins+by+transient+expression+in+Mammalian+cells.">The production of glycoproteins by transient expression in Mammalian cells.</a> Methods Mol. Biol. 498, 245-263 (2009).</li><li>Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetherin+inhibits+retrovirus+release+and+is+antagonized+by+HIV-1+Vpu.">Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu.</a> Nature. 451, 425-430 (2008).</li><li>Nakamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterodimerization+of+the+IL-2+receptor+beta-+and+gamma-chain+cytoplasmic+domains+is+required+for+signalling.">Heterodimerization of the IL-2 receptor beta- and gamma-chain cytoplasmic domains is required for signalling.</a> Nature. 369, 330-333 (1994).</li><li>Wang, X., Rickert, M., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+quaternary+complex+of+interleukin-2+with+its+alpha,+beta,+and+gammac+receptors.">Structure of the quaternary complex of interleukin-2 with its alpha, beta, and gammac receptors.</a> Science. 310, 1159-1163 (2005).</li></ol>

10 katmanı hücre fabrikalarda protein miligram miktarlarda üretilmesi için etkili bir kap olup. Bu tür roller şişeleri, erlenlere veya spinner matara gibi diğer geleneksel gemiler, üzerinde hücre fabrika kullanarak önemli bir avantajı da herhangi bir ek laboratuar ekipman alımı gerekmez olmasıdır. Standart bir CO 2 inkübatör (~ 6.0 cu. Ft) kolayca dört adet 10-katmanlı hücre fabrikalar (Şekil 2) uygun olacaktır. Buna ek olarak, bu kapların tabaklar, şişeler ya hücre...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Alkalen fosfataz (BCIP / NBT) sıvı substrat çözeltisi </td><td> Sigma </td><td> B6404 </td><td></td></tr><tr><td> Antimikotik / Antibiyotik, 100X </td><td> Invitrogen </td><td> 15240062 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-HA afinite matriks, klon 3F10 </td><td> Roche </td><td> 1815016 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-HA fare mAb, klon 16B12 </td><td> Covance </td><td> MMS-101P </td><td></td></tr><tr><td> Hücre kültürü şişesi, T75 cm 2 doku kültürü tedavi </td><td> Corning </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> Hücre kültürü şişesi, T225 cm 2 doku kültürü tedavi </td><td> Corning </td><td> 431082 </td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü plakaları ,6-de doku kültürü tedavi </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td></td></tr><tr><td> Hücre fabrikası, 10 katmanlı CellSTACK </td><td> Corning </td><td> 3312 </td><td></td></tr><tr><td> Centramate Omega 5K Kaset </td><td> Bıktırmak </td><td> OS005C12 </td><td></td></tr><tr><td> Centramate Omega 30K Kaset </td><td> Bıktırmak </td><td> OS030C12 </td><td></td></tr><tr><td> Kromatografi cam kolon, 1.0x10 cm </td><td> Kontes </td><td> 4204001010 </td><td></td></tr><tr><td> Siprofloksasin </td><td> Sigma </td><td> 17850 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;nun değiştirilmiş Eagle ortamı (DMEM) </td><td> Sigma </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal bovin serumu (FBS), aktifliği giderilmiş ısıya </td><td> Invitrogen </td><td> 12484-028 </td><td></td></tr><tr><td> FuGENE HD transfeksiyon reaktif </td><td> Promega </td><td> 4709691001 </td><td></td></tr><tr><td> GeneJuice transfeksiyon reaktif </td><td> EMD / Merck </td><td> 70967-6 </td><td></td></tr><tr><td> Glisin </td><td> Sigma </td><td> G8898 </td><td></td></tr><tr><td> Alkali keçi anti-fare IgG F (ab &#39;) 2 </td><td> Thermo Scientific </td><td> 31324 </td><td></td></tr><tr><td> fosfataz bağlı antikor </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hemagglutinin (HA) peptid, 100 mg </td><td> Genscript </td><td> özel sentezi </td><td></td></tr><tr><td> (Sırası: YPYDVPDYA,% 95 saflıkta) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> HEK 293T hücreleri </td><td> ATCC </td><td> CRL-11268 </td><td></td></tr><tr><td> Household ağartıcı (4% w / v sodyum hipoklorit) </td><td> çeşitli markalarda mevcuttur </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Immobilon-P PVDF zarı </td><td> Millipore </td><td> IPVH07850 </td><td></td></tr><tr><td> MiniPrep plazmid saflaştırma kiti, PureLink Hızlı </td><td> Invitrogen </td><td> K2100-11 </td><td></td></tr><tr><td> MaxiPrep plazmid saflaştırma kiti, PureLink HiPure </td><td> Invitrogen </td><td> K2100-07 </td><td></td></tr><tr><td> NaH3 </td><td> Sigma </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> pDISPLAY ekspresyon vektörü </td><td> Invitrogen </td><td> V660-20 </td><td></td></tr><tr><td> 100X penisilin / streptomisin (pen / strep), </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfat tamponlu tuz (PBS), steril 1X </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> Polietilenimin (PEI), lineer 25 kDa </td><td> Polyscience </td><td> 23966 </td><td></td></tr><tr><td> Süt yağsız kuru toz </td><td> Karanfil </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stericup-GP PES vakum filtrasyon ünitesi, </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td><td></td></tr><tr><td> 0.22 mikron, 500 ml kapasiteli </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tripan mavisi </td><td> Invitrogen </td><td> 15250061 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsin-EDTA,% 0.05 (a / h) </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Sigma </td><td> P7949 </td><td></td></tr><tr><td> Valproik asit </td><td> Sigma </td><td> P4543 </td><td></td></tr><tr><td> Teğetsel akış sistemi Centramate </td><td> Bıktırmak </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CO 2 nemlendirilmiş inkübatör, standart 6.0 cu. ft </td><td> çeşitli markalarda mevcuttur </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Elektroforez ve transfer ünitesi </td><td> çeşitli markalarda mevcuttur </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Inkübatöründe, 37 ° C </td><td> çeşitli markalarda mevcuttur </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells

Bakterilerde rekombinant protein ekspresyonu, tipik E. coli, proteinlerin miligram miktarı ifadesi için en başarılı bir strateji olmuştur. Bununla birlikte, çoğu zaman prokaryotik hosts bakteriler, özellikle co-veya post-translasyon modifikasyonların eksikliğinden kaynaklanan, insan, viral veya ökaryotik yabancı makromolekülün toksisite bağlı proteinler, protein katlama makine farklılıklar, ya da ifade için uygun değildir. Maya (P. pastoris ya S. cerevisiae), 1,2,-bakülovirüs bulaştırılmış böcek (S. frugiperda veya T. ni) hücreler 3, in vitro ve in sistemleri için hücre içermeyen temel ekspresyon sistemleri 2,4 başarıyla için kullanılmıştır memeli proteinleri üretmek. Muhtemelen iyi eşleşme post-translasyon uygun değişiklikler içeren rekombinant proteinlerin üretimini sağlamak için bir memeli konak kullanmaktır. Memeli hücre çizgileri (insan embriyonik Çocuk bir diziney (HEK) 293, S V40 larget T-antijen (COS), Çin Hamsteri Över (CHO), ve diğerleri taşıyan O rigin C V-1 hücreleri) başarılı bir şekilde insan proteinleri bir dizi miligram miktarlarda olarak artmış için kullanılmıştır 5-9. Ancak, memeli hücrelerinde kullanmanın avantajları genellikle istikrarlı ifade hücre hatları geliştirmek için yüksek maliyetleri, özel laboratuvar ekipman ihtiyacı, düşük protein verimi ve uzun zamanlar göre karşılık. Maliyetleri düşük tutarken, daha hızlı verim ve üretim protein artırılması, pek çok akademik ve ticari laboratuarlar için önemli faktörlerdir. Burada, bir zaman ve yapışık HEK 293T hücrelerinden salgılanan insan proteinlerinin ifadesi için maliyet-etkin, iki bölümlü bir prosedür tanımlamaktır. Bu sistem, yapısal biyofiziksel ve biyokimyasal çalışmalar için işlevsel proteinin miligram miktarda mikrogram üretme kapasitesine sahiptir. İlk bölümde, ilgi genin birden yapıları üretmek vardırparalel ve geçici olarak küçük ölçekli yapışık HEK 293T hücrelerine transfekte d. Hücre kültürü aracı maddesine salgılandı rekombinant protein saptama ve analiz Bir vektör olarak kodlanmış proteine ​​karşı yöneltilmiş saflaştırma etiketi ticari olarak mevcut antikorlar kullanılarak Western blot analizi ile gerçekleştirilir. Daha sonra, büyük ölçekli bir protein üretime uygun yapıları geçici 10-tabaka hücre fabrikalarda polietilenimin (PEI) ile transfekte edilir. Şartlandırılmış orta litrelik-hacim içine salgılanan proteinler, anti-HA afinite kromatografisi ile saflaştırma, ardından teğet akış filtrasyonu kullanılarak kontrol edilebilir miktarlar halinde konsantre edilmiştir. Bu platformun programı sitokinler, sitokin reseptörleri, hücre yüzey reseptörleri, içsel kısıtlama faktörler ve viral glikoproteinler miligram miktarlarda ifade yeteneğini kanıtladı. Bu yöntem de başarılı bir şekilde trimeric ebolavirus glikoprotein 5,10 yapısal tayini kullanılmıştır. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Sonuç olarak, bu platform protein kalitesi ve işlevsellik maksimize ederken kullanımı, hız ve ölçeklenebilirlik kolaylığı sunuyor. Dahası, bir standart nemlendirilmiş CO2 inkübatöründe haricinde hiçbir ilave ekipman, gereklidir. Bu prosedür, hızlı protein kompleksleri, antijenler ve antikorlar, aşılar için üretim virüse benzer parçacıklar, ya da zor bir hücre hatları transdüksiyonu için adenovirüsler ya Lentivirüs üretimi müşterek ifadesinden olarak daha büyük bir karmaşıklık sistemleri için genişletilebilir.

Watch this Scientific Journal Video about A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells at JoVE.com

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Post-insan genomik dönemde, yerli konformasyonlar rekombinant protein durumu, yapısal, işlevsel ve tedavi araştırma ve geliştirme için çok önemlidir. Burada, bir test-ve rekombinant proteinlerin çeşitli üretmek için kullanılan insan embriyonik böbrek hücreleri 293T büyük ölçekli proteini ifade sistemi açıklamaktadır.

İnsan Hücrelerden salgılanan Proteinlerin Üretimi için Kullanışlı ve Genel Anlatım Platformu

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

İnsan Embriyonik Kök Hücre (ES) yayılması

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

EMBL de MultiBac Protein Complex Üretim Platformu

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Rekombinant Proteinlerin Yüksek-düzey Geçici İfade için Bitkiler Verimli Agroinfiltration

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Verimli Üretimi ve Saflaştırılması Rekombinant murin kindlin-3 Biophysical Çalışmaları Böcek hücrelerinden

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Kütle Spektrometresi Analizi için Peptitler içine Dokular ve Sindirim gelen Ekstrasellüler Matriks Proteinleri zenginleştirilmesi

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

Süspansiyon HEK293 hücrelerinin kısa süreli transfection ile Rekombinant İnsan Proteinlerinin Yüksek Verimli İfadesi

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...