Name: measuring cell cycle progression kinetics with metabolic labeling and flow cytometry
Uploaded: 2012-05-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry at JoVE.com

Wir danken Andy Johnson von der Biomedical Research Center an der UBC für die Unterstützung bei FACS-Analyse. Cancer Research Funding im Wong Laboratory wird von der kanadischen Krebsgesellschaft Research Institute (Betriebskostenzuschuss # 019250) und vom Forschungszentrum Reinvestment Mittel der Fakultät für Pharmazeutische Wissenschaften, UBC zur Verfügung gestellt. JMYW wird durch die Forschung Kanada Stühle und der Michael Smith Foundation for Health Research Career Development Programme unterstützt.

1. Zellpräparation <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig0.jpg" alt="Abbildung 0" /> <ol><li> Tafel Zellen eine D...

<ol>
	<li>Musgrove, E. A., Caldon, C. E., Barraclough, J., Stone, A., Sutherland, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+D+as+a+therapeutic+target+in+cancer.">Cyclin D as a therapeutic target in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 11, 558-572 (2011).</li><li>Molchadsky, A., Rivlin, N., Brosh, R., Rotter, V., Sarig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+is+balancing+development,+differentiation+and+de-differentiation+to+assure+cancer+prevention.">p53 is balancing development, differentiation and de-differentiation to assure cancer prevention.</a> Carcinogenesis. 31, 1501-1508 (2010).</li><li>Dickson, M. A., Schwartz, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell-cycle+inhibitors+for+cancer+therapy.">Development of cell-cycle inhibitors for cancer therapy.</a> Curr. Oncol. 16, 36-43 (2009).</li><li>Banfalvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+synchronization+of+animal+cells+and+nuclei+by+centrifugal+elutriation.">Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation.</a> Nat. Protoc. 3, 663-673 (2008).</li><li>van Opstal, A., Boonstra, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+phosphatidylinositol+3-kinase+activity+prevent+cell+cycle+progression+and+induce+apoptosis+at+the+M/G1+transition+in+CHO+cells.">Inhibitors of phosphatidylinositol 3-kinase activity prevent cell cycle progression and induce apoptosis at the M/G1 transition in CHO cells.</a> Cell Mol. Life Sci. 63, 220-228 (2006).</li><li>Gasnereau, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+to+sort+mammalian+cells+in+cytokinesis.">Flow cytometry to sort mammalian cells in cytokinesis.</a> Cytometry. A. 71, 1-7 (2007).</li><li>Harper, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+cell+populations+in+G1/S+and+G2/M+phases+of+the+cell+cycle.">Synchronization of cell populations in G1/S and G2/M phases of the cell cycle.</a> Methods Mol. Biol. 296, 157-166 (2005).</li><li>Pedrali-Noy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+HeLa+cell+cultures+by+inhibition+of+DNA+polymerase+alpha+with+aphidicolin.">Synchronization of HeLa cell cultures by inhibition of DNA polymerase alpha with aphidicolin.</a> Nucleic Acids Res. 8, 377-387 (1980).</li><li>Merrill, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+synchronization.">Cell synchronization.</a> Methods Cell Biol. 57, 229-249 (1998).</li><li>Fleisig, H. B., Wong, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+promotes+efficient+cell+cycle+kinetics+and+confers+growth+advantage+to+telomerase-negative+transformed+human+cells.">Telomerase promotes efficient cell cycle kinetics and confers growth advantage to telomerase-negative transformed human cells.</a> Oncogene. , (2011).</li><li>Cai, D., Byth, K. F., Shapiro, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AZ703,+an+imidazo[1,2-a]pyridine+inhibitor+of+cyclin-dependent+kinases+1+and+2,+induces+E2F-1-dependent+apoptosis+enhanced+by+depletion+of+cyclin-dependent+kinase+9.">AZ703, an imidazo[1,2-a]pyridine inhibitor of cyclin-dependent kinases 1 and 2, induces E2F-1-dependent apoptosis enhanced by depletion of cyclin-dependent kinase 9.</a> Cancer Res. 66, 435-444 (2006).</li><li>Pozarowski, P., Darzynkiewicz, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+cycle+by+flow+cytometry.">Analysis of cell cycle by flow cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 281, 301-311 (2004).</li><li>Sherwood, S. W., Rush, D. F., Kung, A. L., Schimke, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+B1+expression+in+HeLa+S3+cells+studied+by+flow+cytometry.">Cyclin B1 expression in HeLa S3 cells studied by flow cytometry.</a> Exp. Cell Res. 211, 275-281 (1994).</li></ol>

Durch die Kombination von Durchflusszytometrie mit BrdU-Einbau, wir haben die notwendigen Werkzeuge, um die Kinetik des Zellzyklus zu studieren. Das markante Eigenschaft von BrdU als Thymidinanalogon funktionieren ist das, was für DNA-Gehalt Quantifizierung einer Rad-Zelle. Der Einbau von BrdU in einen wachsenden Tochter-DNA-Strang während der Synthese-Phase des Zellzyklus ist, was erlaubt es, eine Subpopulation von Zellen handelt durch die Replikation der DNA in S-Phase zu folgen, einer Wachstumsphase bei G2 und schl...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Bromdesoxyuridin </td><td> Becton Dickinson </td><td> 55089 </td><td></td></tr><tr><td> Propidiumiodid </td><td> Sigma </td><td> 287075 </td><td> 1mg/ml Lager </td></tr><tr><td> FITC-anti-BrdU </td><td> Becton Dickinson </td><td> 347583 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumtetraborat </td><td> Fischer </td><td> S80172 </td><td> 0,1 M, pH 8,5 </td></tr><tr><td> FACS Caliber </td><td> Becton Dickinson </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measuring cell cycle progression kinetics with metabolic labeling and flow cytometry

Präzise Kontrolle der Einleitung, die Progression durch die verschiedenen Phasen des Zellzyklus sind von größter Bedeutung in proliferierenden Zellen. Handy-Zyklus-Teilung ist ein integraler Bestandteil von Wachstum und Vermehrung und Deregulierung wichtiger Zellzyklus Komponenten in den auslösende Ereignisse der Karzinogenese 1,2 gebracht. Molekulare Wirkstoffe in Anti-Krebs-Therapien zielen häufig biologische Pfade für die Regulation und Koordination von Zellzyklus-Division 3. Obwohl Zellzykluskinetik bis nach Zelltyp unterschiedlich neigen, ist die Verteilung der Zellen unter den vier Phasen des Zellzyklus und nicht konsistent innerhalb einer bestimmten Zelllinie durch die ständige Praxis Mitogen und Wachstumsfaktor Ausdruck. Gentoxische Ereignisse und andere zelluläre Stressoren können in einem temporären Block des Zellzyklus führen, was zu einer vorübergehenden Festnahme oder Pause in einer bestimmten Zelle Zyklusphase für Institutionen ermöglichensuchung der entsprechenden Antwort-Mechanismus. Die Fähigkeit, experimentell zu beobachten, das Verhalten einer Zellpopulation mit Bezug auf die Zellzyklusprogression Stufe ist ein wichtiger Fortschritt in der Zellbiologie. Gemeinsame Verfahren wie die mitotische abzuschütteln, differentielle Zentrifugation oder auf Basis der Durchflusszytometrie Sortierung werden verwendet, um Zellen in bestimmten Phasen des Zellzyklus 4-6 zu isolieren. Diese fraktionierte, Zellzyklus-Phase angereicherte Populationen werden dann auf experimentelle Behandlungen unterzogen. Ausbeute, Reinheit und Lebensfähigkeit der getrennten Fraktionen können oft kompromittiert Verwendung dieser physikalische Trennverfahren werden. Wie gut, kann die Zeitspanne zwischen Trennung der Zellpopulationen und dem Beginn der experimentellen Behandlung, wobei die Zellen aus der fraktionierten ausgewählten Zellzyklus-Stadium fortschreiten kann, vor erhebliche Herausforderungen bei der erfolgreichen Umsetzung und Interpretation dieser Experimente. Andere Ansätze zur Study Zellzyklusstadien umfassen die Verwendung von Chemikalien, um Zellen zu synchronisieren. Behandlung der Zellen mit chemischen Inhibitoren der wichtigsten Stoffwechselprozesse für jede Phase des Zellzyklus sind nützlich bei der Blockierung der Verlauf des Zellzyklus zur nächsten Stufe. Zum Beispiel, begrenzen die Ribonucleotid-Reduktase-Inhibitor Hydroxyharnstoff hält Zellen in der G1 / S Stelle durch die Zufuhr von Desoxynukleotiden, die Bausteine ​​von DNA. Andere bemerkenswerte Chemikalien umfassen eine Behandlung mit Aphidicolin, um eine Polymerase-Inhibitor alpha für G1-Arrest, Behandlung mit Colchicin und Nocodazol, die beide mit mitotischen Spindel stören Zellen in M-Phase zu stoppen und schließlich die Behandlung mit dem DNA-Kettenterminator 5-fluorodeoxyridine zu initiieren S-Phase Festnahme 09.07. Die Behandlung mit diesen Chemikalien ist ein wirksames Mittel zur Synchronisation eines gesamten Population von Zellen in einer bestimmten Phase. Mit Entfernung der chemischen herkommend Zellen den Zellzyklus unisono. Die Behandlung des Testmittels folgenden Releaseaus dem Zellzyklus blockierende chemische sichergestellt, dass die Reaktion auf Arzneimittel hervorgerufen von einer gleichförmigen, Phase des Zellzyklus-spezifischen Population ist. Allerdings sind da viele der chemischen Synchronisierungen genotoxische Verbindungen bekannt, Hänseleien auseinander die Beteiligung der verschiedenen Response-Wege (zu den Synchronisierungen im Vergleich zu den Test-Agenten) ist eine Herausforderung. Hier beschreiben wir eine Methode zur metabolischen Markierung nach einer Subpopulation von Zellen aktiv Radfahren durch ihre Progression aus der DNA-Replikation Phase, durch die Teilung und Trennung von ihren Tochterzellen. In Verbindung mit Durchflusszytometrie Quantifizierung ermöglicht dieses Protokoll für die Messung der kinetischen Fortschreiten des Zellzyklus in Abwesenheit von entweder mechanisch oder chemisch induzierte zelluläre betont gewöhnlich mit anderen Zellzyklus-Synchronisation Methoden 10 zugeordnet ist. In den folgenden Abschnitten werden wir die Methodik, sowie einige seiner Anwendungen in der biomedizinischen Forschung.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry at JoVE.com

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Tracking-feine Veränderungen in der Progression und die Kinetik der Zellzyklusstadien kann durch Verwendung einer Kombination von metabolische Markierung von Nukleinsäuren mit BrdU und genomischer Gesamt-DNA-Färbung über Propidiumiodid durchgeführt werden. Dieses Verfahren vermeidet die Notwendigkeit von chemischen Synchronisation der Rad-Zellen, wodurch die Einführung von nicht-spezifischen DNA-Schäden, die sich wiederum auf den Ablauf des Zellzyklus.

Mess-Zellzyklus-Progression Kinetics mit Metabolische Markierung und Durchflusszytometrie

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

Mess-Exocytose in Neuronen mit FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Forschung

Biologie

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

Studieren Membrane Biogenesis mit einem Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Durchflusszytometrie Reinigung der Maus meiotischen Zellen

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Durchflusszytometrie-basierte Reinigung von<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimiert Färbung und Proliferation Modeling-Methoden für die Zellteilung Überwachung mit Cell-Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Mess-intrazellulären Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Änderungen in menschlichen Spermien mit vier Techniken: Konventionelle Fluorometrie, Stopped Flußfluorometrie, Durchflusszytometrie und Single Cell Imaging

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Metabolische Markierung von Leucin Rich-Repeat-Kinasen 1 und 2 mit radioaktivem Phosphat

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolische Markierung und Membran Fraktionierung für Vergleichende Proteomanalyse von<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Fahrwerk Zellkulturen

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

Zeitliche Verfolgung von Zellzyklus mittels Durchflusszytometrie, ohne die Notwendigkeit für die Synchronisation

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

LED Thermo Flow - Die Kombination mit Optogenetik Flow Cytometry

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...