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Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

University of British Columbia 

&#x6211;&#x4EEC;&#x4EE5;&#x524D;&#x66FE;&#x62A5;&#x9053; TRPV4 &#x548C; TRPC1 &#x53EF;&#x4EE5; co-assemble &#x5230;&#x7A97;&#x4F53;&#x7684;&#x7F1D;&#x9699; TRPV4 C1 &#x6E20;&#x9053; [12]&#x3002;&#x5728;&#x672C;&#x7814;&#x7A76;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x4E3A;&#x7279;&#x70B9;&#x7F1D;&#x9699; TRPV4 C1 &#x6E20;&#x9053;&#x4E00;&#x4E9B;&#x57FA;&#x672C;&#x7535;&#x751F;&#x7406;&#x7684;&#x7279;&#x6027;&#x3002;4&Alpha;-&#x4F5B;&#x6CE2; 12,13 didecanoate TRPV4 &#x6FC0;&#x52A8;&#x5242; 4&alpha; PDD&#xFF09; &#x6FC0;&#x6D3B;&#x5F53;&#x524D;&#x5728;&#x4EBA;&#x80DA;&#x80CE;&#x80BE; 293 &#x7EC6;&#x80DE;&#x5DE5;&#x7A0B;&#x83CC; TRPV4 &#x548C; TRPC1 &#x4E2D;&#x7684;&#x5355;&#x901A;&#x9053;&#x3002;TRPC1 &#x9488;&#x5BF9;&#x963B;&#x6B62;&#x6297;&#x4F53; T1E3 &#x7684;&#x60C5;&#x51B5;&#x4E0B;&#xFF0C;&#x6D3B;&#x52A8;&#x7684;&#x6E20;&#x9053;&#x88AB;&#x6B63;&#x5F0F;&#x5E9F;&#x6B62;&#x3002;&#x901A;&#x9053;&#x7684;&#x7535;&#x5BFC;&#x662F; ~ 95pS &#x5916;&#x5411;&#x7535;&#x6D41;&#x548C; ~ 83pS &#x62B5;&#x6E2F;&#x7684;&#x7535;&#x6D41;&#x3002;&#x4E0E;&#x7C7B;&#x4F3C;&#x7535;&#x5BFC;&#x6E20;&#x9053;&#x4E5F;&#x5F55;&#x5F97;&#x8868;&#x793A; TRPV4 C1 concatamers&#xFF0C;&#x5176;&#x4E2D;&#x7EC4;&#x88C5;&#x7684;&#x6E20;&#x9053;&#x9884;&#x8BA1;&#x5C06;&#x4E3B;&#x8981;&#x662F; 2V4:2 C 1 &#x7684;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x3002;&#x8367;&#x5149;&#x5171;&#x632F;&#x80FD;&#x91CF;&#x8F6C;&#x79FB; &#xFF08;&#x97F3;&#x54C1;&#xFF09; &#x5B9E;&#x9A8C;&#x8BC1;&#x5B9E;&#x7684;&#x590D;&#x6742;&#x4E0E; 2V4:2 C &#x86CB;&#x767D;&#x5F62;&#x6210;&#x540C;&#x65F6;&#x5EFA;&#x8BAE; unlikeliness &#x7684; 3V4:1 C 1 &#x5316;&#x5B66;&#x8BA1;&#x91CF;&#x5B66; 1 &#x6216; 1V4:3 C 1 &#x5316;&#x5B66;&#x8BA1;&#x91CF;&#x5B66;&#x3002;&#x5355;&#x4EF7;&#x9633;&#x79BB;&#x5B50;&#x6E17;&#x900F;&#x914D;&#x7F6E;&#x6587;&#x4EF6;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7F1D;&#x9699; TRPV4 C1 &#x548C; homomeric TRPV4 &#x6E20;&#x9053;&#x8FDB;&#x884C;&#x4E86;&#x6BD4;&#x8F83;&#x3002;&#x7F1D;&#x9699; TRPV4 C1 &#x9891;&#x9053;&#xFF0C;&#x627E;&#x5230;&#x5176;&#x6E17;&#x900F;&#x914D;&#x7F6E;&#x6587;&#x4EF6;&#x4EE5;&#x9002;&#x5408; &middot; &#x827E;&#x68EE;&#x5E8F;&#x5217;&#x516D;&#xFF0C;&#x6307;&#x793A;&#x6027;&#x7684;&#x7EA6;&#x675F;&#x529B;&#x7684;&#x7F51;&#x7AD9;&#xFF0C;&#x800C; homomeric TRPV4 &#x9891;&#x9053;&#xFF0C;&#x5176;&#x6E17;&#x900F;&#x914D;&#x7F6E;&#x6587;&#x4EF6;&#x7B49;&#x4E8E;&#x5F31;&#x573A;&#x5F3A;&#x5EA6;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x7AD9;&#x70B9; &middot; &#x827E;&#x68EE;&#x5E8F;&#x5217;&#x56DB;&#x5F3A;&#x573A;&#x5F3A;&#x5EA6;&#x9633;&#x79BB;&#x5B50;&#x3002;&#x4E0E; homomeric TRPV4 &#x6E20;&#x9053;&#x76F8;&#x6BD4;&#xFF0C;&#x7F1D;&#x9699; TRPV4 C1 &#x6E20;&#x9053;&#x7A0D;&#x5FAE;&#x6E17;&#x900F;&#x5230; Ca2 +&#xFF0C;&#x654F;&#x611F;&#x6027;&#x964D;&#x4F4E;&#x80DE;&#x5916; Ca2 + &#x6291;&#x5236;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;&#x603B;&#x4E4B;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x53D1;&#x73B0;&#xFF0C;&#x5F53; TRPV4 &#x548C; TRPC1 &#x5728;&#x4EBA;&#x80DA;&#x80CE;&#x80BE; 293 &#x7EC6;&#x80DE;&#x591A;&#x53D1;&#x6027;&#x9AA8;&#x9AD3;&#x7624;&#xFF0C;&#x5370;&#x5730;&#x8BED;&#x7684;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x96C6;&#x7C7B;&#x578B;&#x662F; 2V4:2 C 1&#x3002;&#x7F1D;&#x9699; TRPV4 C1 &#x9891;&#x9053;&#x663E;&#x793A;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x7535;&#x751F;&#x7406;&#x7279;&#x6027;&#x6709;&#x522B;&#x4E8E;&#x90A3;&#x4E9B; homomeric TRPV4 &#x6E20;&#x9053;&#x3002;

TRPV4 C1 &#x7F1D;&#x9699;&#x901A;&#x9053;&#x7535;&#x751F;&#x7406;&#x7279;&#x6027;&#x3002;

We previously reported that TRPV4 and TRPC1 can co-assemble to form heteromeric TRPV4-C1 channels [12]. In the present study, we characterized some basic electrophysiological properties of heteromeric TRPV4-C1 channels. 4Î±-Phorbol 12,13-didecanoate (4Î±-PDD, a TRPV4 agonist) activated a single channel current in HEK293 cells co-expressing TRPV4 and TRPC1. The activity of the channels was abrogated by a TRPC1-targeting blocking antibody T1E3. Conductance of the channels was ~95pS for outward currents and ~83pS for inward currents. The channels with similar conductance were also recorded in cells expressing TRPV4-C1 concatamers, in which assembled channels were expected to be mostly 2V4:2C1. Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) experiments confirmed the formation of a protein complex with 2V4:2C1 stoichiometry while suggesting an unlikeliness of 3V4:1C1 or 1V4:3C1 stoichiometry. Monovalent cation permeability profiles were compared between heteromeric TRPV4-C1 and homomeric TRPV4 channels. For heteromeric TRPV4-C1 channels, their permeation profile was found to fit to Eisenman sequence VI, indicative of a strong field strength cation binding site, whereas for homomeric TRPV4 channels, their permeation profile corresponded to Eisenman sequence IV for a weak field strength binding site. Compared to homomeric TRPV4 channels, heteromeric TRPV4-C1 channels were slightly more permeable to Ca2+ and had a reduced sensitivity to extracellular Ca2+ inhibition. In summary, we found that, when TRPV4 and TRPC1 were co-expressed in HEK293 cells, the predominate assembly type was 2V4:2C1. The heteromeric TRPV4-C1 channels display distinct electrophysiological properties different from those of homomeric TRPV4 channels.

Electrophysiological properties of heteromeric TRPV4-C1 channels.

Nous avons d&eacute;j&agrave; indiqu&eacute; que TRPV4 et TRPC1 peuvent co-assembl&eacute;es pour former des canaux TRPV4-C1 h&eacute;t&eacute;rom&eacute;rique [12]. Dans la pr&eacute;sente &eacute;tude, nous avons caract&eacute;ris&eacute; certaines propri&eacute;t&eacute;s &eacute;lectrophysiologiques base de canaux h&eacute;t&eacute;rom&eacute;rique TRPV4-C1. 4&Alpha;-Phorbol 12, 13-did&eacute;canoate (4&alpha;-Ted, un agoniste TRPV4) activ&eacute; un seul canal actuel dans les cellules HEK293 co-expressing TRPV4 et TRPC1. L&#39;activit&eacute; des canaux a &eacute;t&eacute; abrog&eacute;e par un anticorps bloquant ciblage TRPC1 T1E3. La conductance des canaux est ~ 95pS pour les courants sortants et ~ 83pS pour les courants entrants. Les canaux avec la conductance similaire ont &eacute;galement &eacute;t&eacute; enregistr&eacute;es dans les cellules exprimant des concat&eacute;m&egrave;res TRPV4-C1, dans lequel des canaux assembl&eacute;s devaient &ecirc;tre surtout 2V4:2 C 1. Exp&eacute;riences de fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) a confirm&eacute; la formation d&#39;une prot&eacute;ine complexe avec 2V4:2 C 1 stoechiom&eacute;trie tout en sugg&eacute;rant une cote de 3V4:1 C 1 ou 1V4:3 C 1 stoechiom&eacute;trie. Cation monovalent perm&eacute;abilit&eacute; profils ont &eacute;t&eacute; compar&eacute;s entre h&eacute;t&eacute;rom&eacute;rique TRPV4-C1 et homom&egrave;res TRPV4 canaux. Pour les canaux h&eacute;t&eacute;rom&eacute;rique TRPV4-C1, leur profil de perm&eacute;ation s&#39;est av&eacute;r&eacute; apte &agrave; Eisenman s&eacute;quence VI, indicatif d&#39;un cation fort champ de force binding site, tandis que pour les canaux homom&egrave;res TRPV4, leur profil de perm&eacute;ation correspondait &agrave; Eisenman s&eacute;quence IV pour un site de liaison de la force de champ faible. Par rapport aux canaux homom&egrave;res TRPV4, h&eacute;t&eacute;rom&eacute;rique TRPV4-C1 cha&icirc;nes &eacute;taient l&eacute;g&egrave;rement plus perm&eacute;ables au Ca2 + et avaient une sensibilit&eacute; r&eacute;duite &agrave; l&#39;inhibition de Ca2 + extracellulaire. En r&eacute;sum&eacute;, nous avons constat&eacute; que, quand TRPV4 et TRPC1 ont &eacute;t&eacute; co-exprim&eacute;e dans les cellules HEK293, le type de montage pr&eacute;dominant &eacute;tait 2V4:2 C 1. Les canaux de TRPV4-C1 h&eacute;t&eacute;rom&eacute;rique affichent les propri&eacute;t&eacute;s &eacute;lectrophysiologiques distinctes diff&eacute;rentes de celles des canaux homom&egrave;res TRPV4.

Propri&eacute;t&eacute;s &eacute;lectrophysiologiques des canaux h&eacute;t&eacute;rom&eacute;rique TRPV4-C1.

Zuvor berichteten wir, dass TRPV4 und TRPC1 Form heteromeren TRPV4-C1 Kan&auml;le [12] co-assemble k&ouml;nnen. In der vorliegenden Studie charakterisiert wir einige grundlegenden elektrophysiologischen Eigenschaften des heteromeren TRPV4-C1-Kan&auml;le. 4&Alpha;-Phorbol 12,13-Didecanoate (4&alpha;-PDD, ein TRPV4-Agonist) aktiviert einen einzigen Kanal aktuelle in HEK293 Zellen, co-expressing, TRPV4 und TRPC1. Die Aktivit&auml;t der Kan&auml;le wurde durch ein TRPC1-Zielgruppenadressierung blockierende Antik&ouml;rper T1E3 aufgehoben. Leitwert der Kan&auml;le war ~ 95pS f&uuml;r nach au&szlig;en Str&ouml;me und ~ 83pS f&uuml;r innere Str&ouml;mungen. Die Kan&auml;le mit &auml;hnlichen Leitwert verzeichneten auch in Zellen, die TRPV4-C1 Concatamers, in denen montierten Kan&auml;le voraussichtlich waren meist 2V4:2 C 1 zum Ausdruck zu bringen. Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET) Experimente best&auml;tigt die Bildung eines Proteins Komplex mit 2V4:2 C 1 St&ouml;chiometrie zwar vorgeschlagen, eine Unlikeliness der 3V4:1 C 1 oder 1V4:3 C 1 St&ouml;chiometrie. Monovalenten kation Durchl&auml;ssigkeit Profile wurden zwischen heteromeren TRPV4-C1 und Homomeric TRPV4 Kan&auml;le verglichen. F&uuml;r heteromeren TRPV4-C1-Kan&auml;le fand ihre Permeation-Profil passen zu Eisenman Sequenz VI, bezeichnend f&uuml;r ein starkes Feld-St&auml;rke-kation, Website, verbindlich, w&auml;hrend f&uuml;r Homomeric TRPV4 Kan&auml;le, ihr Profil Permeation Eisenman Sequenz IV f&uuml;r ein schwaches Feld-St&auml;rke-Bindungsstelle entsprach. Im Vergleich zu Homomeric TRPV4 Kan&auml;le, heteromeren TRPV4-C1-Kan&auml;le waren etwas durchl&auml;ssiger zu Ca2 + und eine geringere Empfindlichkeit gegen&uuml;ber extrazellul&auml;re Ca2 + Hemmung. Zusammenfassend l&auml;sst sich sagen fanden wir, dass ich bei TRPV4 und TRPC1 co-expressed in HEK293 Zellen waren die Montageart Gregorianische 2V4:2 C 1. Die heteromeren TRPV4-C1-Kan&auml;le zeigen verschiedene elektrophysiologische Eigenschaften von denen des Homomeric TRPV4 Kan&auml;le.

Elektrophysiologische Eigenschaften des heteromeren TRPV4-C1-Kan&auml;le.

Abbiamo segnalato in precedenza che TRPV4 e TRPC1 pu&ograve; co-assemble a canali di forma eteromerico TRPV4-C1 [12]. Nel presente studio, abbiamo caratterizzato alcune propriet&agrave; elettrofisiologiche base dei canali eteromerico TRPV4-C1. 4&Alpha;-forbolo 12,13-didecanoate (4&alpha;-PDD, un agonista TRPV4) attivato un singolo canale corrente nelle cellule HEK293 co-expressing TRPV4 e TRPC1. L&#39;attivit&agrave; dei canali &egrave; stata abolita da un anticorpo blocco TRPC1-targeting T1E3. Conduttanza dei canali era ~ 95pS per correnti verso l&#39;esterno e ~ 83pS per correnti verso l&#39;interno. I canali con conduttanza simile sono stati registrati anche in cellule che esprimono concatamers TRPV4-C1, in cui canali assemblati dovevano essere principalmente 2V4:2 C 1. Fluorescenza Resonance Energy Transfer (FRET) esperimenti hanno confermato la formazione di una proteina complessa con 2V4:2 C 1 stechiometria pur suggerendo un plausibili 3V4:1 C 1 o 1V4:3 C 1 stechiometria. Profili di permeabilit&agrave; di cationi monovalenti sono stati confrontati tra homomeric TRPV4 canali ed eteromerici TRPV4-C1. Per i canali eteromerico TRPV4-C1, loro profilo di permeazione &egrave; stato trovato per adattarsi a Eisenman sequenza VI, indicativo di un catione di forza forte campo binding sito, mentre per i canali homomeric TRPV4, loro profilo di permeazione corrispondeva a Eisenman sequenza IV per un sito di legame di campo debole resistenza. Rispetto ai canali homomeric TRPV4, eteromerico TRPV4-C1 canali erano leggermente pi&ugrave; permeabile a Ca2 + e ha avuto una ridotta sensibilit&agrave; all&#39;inibizione Ca2 + extracellulare. In sintesi, abbiamo trovato che, quando TRPV4 e TRPC1 sono stati espressi nelle cellule HEK293, il tipo di assembly predominante era 2V4:2 C 1. I canali di TRPV4-C1 eteromerico visualizzazione distinte Propriet&agrave; elettrofisiologiche differenti da quelli dei canali homomeric TRPV4.

Propriet&agrave; elettrofisiologiche dei canali eteromerico TRPV4-C1.

&#x4EE5;&#x524D;&#x3001;&#x6211;&#x3005; &#x306F; TRPV4 &#x3068; TRPC1 &#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30E0; heteromeric TRPV4 C1 &#x30C1;&#x30E3;&#x30F3;&#x30CD;&#x30EB; [12] &#x304C; co-assemble &#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x5831;&#x544A;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x672C;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x306F;, heteromeric C1 TRPV4 &#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306E;&#x57FA;&#x672C;&#x7684;&#x306A;&#x96FB;&#x6C17;&#x751F;&#x7406;&#x5B66;&#x7684;&#x6027;&#x8CEA;&#x3092;&#x7279;&#x5FB4;&#x3068;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;4&Alpha; &#x2010; &#x30DB;&#x30EB;&#x30DC;&#x30FC;&#x30EB; 12, 13-didecanoate &#xFF08;4&alpha; PDD&#x3001;TRPV4 &#x30A2;&#x30B4;&#x30CB;&#x30B9;&#x30C8;&#xFF09; TRPV4 &#x3068; TRPC1 co-expressing HEK293 &#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x5358;&#x4E00;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x96FB;&#x6D41;&#x3092;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x3002;&#x30C1;&#x30E3;&#x30F3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306E;&#x6D3B;&#x52D5;&#x306F;&#x3001;TRPC1 &#x3092;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8; &#x30D6;&#x30ED;&#x30C3;&#x30AD;&#x30F3;&#x30B0;&#x6297;&#x4F53;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066; T1E3 abrogated &#x3060;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306E;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C0;&#x30AF;&#x30BF;&#x30F3;&#x30B9;&#x3060;&#x3063;&#x305F; &#x301C; &#x5916;&#x5411;&#x304D;&#x96FB;&#x6D41;&#x306B;&#x5BFE;&#x3059;&#x308B; 95pS &#x3068; ~ &#x5185;&#x5411;&#x304D;&#x96FB;&#x6D41;&#x3092; 83pS&#x3002;&#x985E;&#x4F3C;&#x306E;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C0;&#x30AF;&#x30BF;&#x30F3;&#x30B9;&#x3068;&#x30C1;&#x30E3;&#x30F3;&#x30CD;&#x30EB;&#x3082;&#x3067;&#x7D44;&#x307F;&#x7ACB;&#x3066;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x30C1;&#x30E3;&#x30F3;&#x30CD;&#x30EB;&#x4E3B; 2V4:2 C 1 &#x304C;&#x4E88;&#x60F3;&#x3055;&#x308C;&#x3001;TRPV4 C1 concatamers &#x3092;&#x767A;&#x73FE;&#x3059;&#x308B;&#x7D30;&#x80DE;&#x3067;&#x8A18;&#x9332;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x86CD;&#x5149;&#x5171;&#x9CF4;&#x30A8;&#x30CD;&#x30EB;&#x30AE;&#x30FC;&#x4F1D;&#x9054; (FRET) &#x5B9F;&#x9A13;&#x78BA;&#x8A8D;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA; 2V4:2 C &#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x306E;&#x5F62;&#x6210;&#x3001;&#x307E;&#x3086;&#x3064;&#x3070; 3V4:1 C &#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x306A;&#x304C;&#x3089; 1 &#x5316;&#x5B66;&#x91CF;&#x8AD6; 1 &#x307E;&#x305F;&#x306F; 1V4:3 C 1 &#x5316;&#x5B66;&#x91CF;&#x8AD6;&#x3002;&#x4E00;&#x4FA1;&#x30AB;&#x30C1;&#x30AA;&#x30F3;&#x306E;&#x900F;&#x78C1;&#x7387;&#x30D7;&#x30ED;&#x30D5;&#x30A1;&#x30A4;&#x30EB; heteromeric TRPV4 C1 &#x3068; homomeric TRPV4 &#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x3092;&#x6BD4;&#x8F03;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;Heteromeric C1 TRPV4 &#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306E;&#x900F;&#x904E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30D5;&#x30A3;&#x30FC;&#x30EB; &#x30A2;&#x30A4;&#x30BC;&#x30F3;&#x30DE;&#x30F3; &#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9; VI homomeric TRPV4 &#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306E;&#x900F;&#x904E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30D5;&#x30A3;&#x30FC;&#x30EB; &#x30FB; &#x30A2;&#x30A4;&#x30BC;&#x30F3;&#x30DE;&#x30F3; &#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9; IV &#x5F31;&#x3044;&#x5206;&#x91CE;&#x5F37;&#x3055;&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x90E8;&#x4F4D;&#x306E;&#x76F8;&#x5F53;&#x306B;&#x5BFE;&#x3057;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x3001;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x306E;&#x5F37;&#x78C1;&#x5834;&#x5F37;&#x5EA6;&#x967D;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x3092;&#x793A;&#x3059;&#x3082;&#x306E;&#x306B;&#x53CE;&#x307E;&#x308B;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x898B;&#x3064;&#x304B;&#x308A;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3067;&#x3057;&#x305F;&#x3002;Homomeric TRPV4 &#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306B;&#x6BD4;&#x3079;&#x308B;&#x3068;&#x3001;heteromeric TRPV4 C1 &#x30C1;&#x30E3;&#x30F3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306F; ca 2 + &#x306B;&#x308F;&#x305A;&#x304B;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x900F;&#x904E;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3001;&#x7D30;&#x80DE;&#x5916; ca 2 + &#x963B;&#x5BB3;&#x611F;&#x53D7;&#x6027;&#x306F;&#x4F4E;&#x4E0B;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x3002;&#x8981;&#x7D04;&#x3059;&#x308B;&#x3068;&#x3001;&#x6211;&#x3005; TRPV4 &#x3068; TRPC1 HEK293 &#x7D30;&#x80DE;&#x3067;&#x306F;&#x30B7;&#x30E7;&#x30A6;&#x30B8;&#x30E7;&#x30A6;&#x30D0;&#x30A8;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x3044;&#x305F;&#x5834;&#x5408;&#x3001;&#x4E00;&#x4E16;&#x3092;&#x98A8;&#x9761;&#x30A2;&#x30BB;&#x30F3;&#x30D6;&#x30EA;&#x578B; 2V4:2 C 1&#x3001;&#x308F;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x3002;Heteromeric C1 TRPV4 &#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB; homomeric TRPV4 &#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x304B;&#x3089;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x500B;&#x5225;&#x306E;&#x96FB;&#x6C17;&#x751F;&#x7406;&#x5B66;&#x7684;&#x30D7;&#x30ED;&#x30D1;&#x30C6;&#x30A3;&#x3092;&#x8868;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

Heteromeric C1 TRPV4 &#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306E;&#x96FB;&#x6C17;&#x751F;&#x7406;&#x5B66;&#x7684;&#x7279;&#x6027;&#x3002;

&#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC774;&#xC804;&#xC5D0; TRPV4 &#xBC0F; TRPC1 &#xD3FC; heteromeric TRPV4 C1 &#xCC44;&#xB110; [12] co-assemble &#xC218; &#xBCF4;&#xB3C4; &#xD588;&#xB2E4;. &#xD604;&#xC7AC;&#xC758; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; heteromeric TRPV4 C1 &#xCC44;&#xB110;&#xC758; &#xBA87; &#xAC00;&#xC9C0; &#xAE30;&#xBCF8;&#xC801;&#xC778; electrophysiological &#xC18D;&#xC131; &#xD2B9;&#xC9D5;. 4&Alpha; Phorbol 12,13-didecanoate (4&alpha;-PDD, TRPV4 &#xAE38; &#xD56D; &#xC81C;) HEK293 &#xC138;&#xD3EC; TRPV4 &#xBC0F; TRPC1 co-expressing&#xC5D0;&#xC11C; &#xD604;&#xC7AC; &#xB2E8;&#xC77C; &#xCC44;&#xB110;&#xC744; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xCC44;&#xB110; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC744; trpc1&#xC744; &#xB300;&#xC0C1;&#xC73C;&#xB85C; &#xCC28;&#xB2E8; &#xCCB4; t1e3&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xD3D0;&#xC9C0; &#xD588;&#xB2E4;. &#xCC44;&#xB110;&#xC758; &#xC804;&#xB3C4;&#xB3C4; ~ 95pS &#xBC14;&#xAE65;&#xCABD;&#xC73C;&#xB85C; &#xC804;&#xB958;&#xC640; ~ &#xC548;&#xCABD;&#xC73C;&#xB85C; &#xC804;&#xB958;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; 83pS. &#xC720;&#xC0AC;&#xD55C; &#xC804;&#xB3C4;&#xB3C4;&#xC640; &#xCC44;&#xB110;&#xB3C4; TRPV4 C1 concatamers, &#xC870;&#xB9BD;&#xB41C; &#xCC44;&#xB110; &#xB300;&#xBD80;&#xBD84; 2V4:2 C 1 &#xB420; &#xAC83;&#xC73C;&#xB85C; &#xC608;&#xC0C1; &#xD588;&#xB2E4;&#xC744; &#xD45C;&#xD604; &#xD558;&#xB294; &#xC140;&#xC5D0; &#xAE30;&#xB85D; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xD615;&#xAD11; &#xACF5;&#xBA85; &#xC5D0;&#xB108;&#xC9C0; &#xC804;&#xC1A1; (FRET) &#xC2E4;&#xD5D8; &#xD655;&#xC778; 2V4:2 C&#xC640; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xD615;&#xC131; 1 stoichiometry 3V4:1 C&#xC758; unlikeliness&#xB97C; &#xC81C;&#xC548; &#xD558;&#xB294; &#xB3D9;&#xC548; 1 &#xB610;&#xB294; 1V4:3 C 1 stoichiometry. &#xC5EC;&#xB7EC;&#xCC28;&#xB840; &#xC591;&#xC774;&#xC628; &#xCE68;&#xD22C;&#xC131; &#xD504;&#xB85C;&#xD544; heteromeric TRPV4-c 1&#xACFC; homomeric TRPV4 &#xCC44;&#xB110; &#xC0AC;&#xC774; &#xBE44;&#xAD50; &#xD588;&#xB2E4;. Heteromeric TRPV4 C1 &#xCC44;&#xB110;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xD22C;&#xACFC; &#xD504;&#xB85C;&#xD544; Eisenman &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4; VI, homomeric TRPV4 &#xCC44;&#xB110;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xD22C;&#xACFC; &#xD504;&#xB85C;&#xD544; Eisenman &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4; 4 &#xC57D;&#xD55C; &#xD544;&#xB4DC; &#xAC15;&#xB3C4; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xC5D0; &#xB300;&#xC751; &#xD558;&#xB294; &#xBC18;&#xBA74; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xAC15;&#xB825;&#xD55C; &#xD544;&#xB4DC; &#xAC15;&#xB3C4; &#xC591;&#xC774;&#xC628;&#xC758; &#xC9C0;&#xD45C;&#xC5D0; &#xB9DE;&#xCD94;&#xAE30; &#xBC1C;&#xACAC; &#xB410;&#xB2E4;. Homomeric TRPV4 &#xCC44;&#xB110;&#xC5D0; &#xBE44;&#xD574; heteromeric TRPV4 C1 &#xCC44;&#xB110; Ca2 + &#xC57D;&#xAC04; &#xB354; &#xD22C;&#xACFC;&#xC131; &#xD588;&#xB2E4; &#xBC0F; &#xC138;&#xD3EC; &#xC678; Ca2 + &#xC5B5;&#xC81C;&#xB97C; &#xAC10;&#xC18C; &#xB41C; &#xAC10;&#xB3C4; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC694;&#xC57D; &#xD558;&#xC790;&#xBA74;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xBC1C;&#xACAC;, TRPV4 &#xBC0F; TRPC1 &#xD588;&#xB2E4; HEK293 &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0;&#xC11C; co-expressed, predominate &#xC5B4;&#xC148;&#xBE14;&#xB9AC; &#xD615;&#xC2DD;&#xC744; 2V4:2 C 1 &#xD588;&#xB2E4;. Heteromeric TRPV4 C1 &#xCC44;&#xB110; homomeric TRPV4 &#xCC44;&#xB110; &#xB2E4;&#xB978; &#xB69C;&#xB837;&#xD55C; electrophysiological &#xC18D;&#xC131;&#xC744; &#xD45C;&#xC2DC; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Heteromeric TRPV4 C1 &#xCC44;&#xB110; electrophysiological &#xC18D;&#xC131;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Divulgamos previamente que TRPV4 y TRPC1 pueden co-assemble a los canales de TRPV4-C1 forma heterom&eacute;ricos [12]. En el presente estudio, hemos caracterizado algunas propiedades electrofisiol&oacute;gicas b&aacute;sicas de canales heterom&eacute;ricos TRPV4-C1. 4&Alpha;-forbol 12, 13-didecanoate (4&alpha;-PDD, un agonista TRPV4) activa un solo canal actual en c&eacute;lulas HEK293 co-expressing TRPV4 y TRPC1. La actividad de los canales fue abrogada por un anticuerpo bloqueo metas de TRPC1 T1E3. Conductancia de los canales fue ~ 95pS para corrientes hacia afuera y ~ 83pS por corrientes hacia adentro. Tambi&eacute;n se registraron los canales con conductancia similar en las c&eacute;lulas que expresan TRPV4-C1 concatamers, en que canales montados deb&iacute;an ser en su mayor&iacute;a 2V4:2 C 1. Experimentos de transferencia de energ&iacute;a de resonancia (FRET) fluorescencia confirmaron la formaci&oacute;n de una prote&iacute;na compleja con 2V4:2 C 1 estequiometr&iacute;a mientras sugiriendo un unlikeliness de 3V4:1 C 1 o 1V4:3 C 1 estequiometr&iacute;a. Perfiles de permeabilidad de cationes monovalentes se compararon entre heterom&eacute;ricos TRPV4-C1 y los canales homomeric TRPV4. Canales heterom&eacute;ricos TRPV4-C1, su perfil de impregnaci&oacute;n se han encontrado para ajustarse a Eisenman secuencia VI, indicativo de un cati&oacute;n de campo fuerte fuerza vinculante sitio, mientras que para los canales homomeric TRPV4, su perfil de impregnaci&oacute;n correspondi&oacute; a Eisenman secuencia IV para un sitio de uni&oacute;n de fuerza de campo d&eacute;bil. En comparaci&oacute;n con los canales homomeric TRPV4, heterom&eacute;ricos TRPV4-C1 canales fueron ligeramente m&aacute;s permeables a Ca2 + y tuvieron una disminuci&oacute;n de la sensibilidad a la inhibici&oacute;n de Ca2 + extracelular. En Resumen, encontramos que, cuando TRPV4 y TRPC1 eran co-expressed en c&eacute;lulas HEK293, el tipo de Asamblea predominante era 2V4:2 C 1. Los canales de TRPV4-C1 heterom&eacute;ricos Mostrar distintas propiedades electrofisiol&oacute;gicas difieren de los canales homomeric TRPV4.

Judy Wong

Faculty of Pharmaceutical Sciences

University of British Columbia

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Judy Wong

.css-o250i3{font-size:18px;font-family:Open Sans,sans-serif;line-height:21.6px;}Faculty of Pharmaceutical Sciences

University of British Columbia

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Faculty of Pharmaceutical Sciences