Name: measuring cell cycle progression kinetics with metabolic labeling and flow cytometry
Uploaded: 2012-05-22T13:00:00
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Ringraziamo Andy Johnson del Centro di Ricerca Biomedica presso la UBC per l&#39;assistenza con l&#39;analisi FACS. Finanziamento della ricerca sul cancro in laboratorio Wong è fornito dalla Canadian Cancer Society Research Institute (sovvenzione di funzionamento # 019250) e dal reinvestimento dei fondi di ricerca della Facoltà di Scienze Farmaceutiche, UBC. JMYW è supportato da sedie di ricerca del Canada e la Fondazione Michael Smith carriera di ricerca per i programmi di sviluppo della salute.

1. Preparazione cellulare <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig0.jpg" alt="Figura 0" /> <ol><li> Cellule piastra ...

<ol>
	<li>Musgrove, E. A., Caldon, C. E., Barraclough, J., Stone, A., Sutherland, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+D+as+a+therapeutic+target+in+cancer.">Cyclin D as a therapeutic target in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 11, 558-572 (2011).</li><li>Molchadsky, A., Rivlin, N., Brosh, R., Rotter, V., Sarig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+is+balancing+development,+differentiation+and+de-differentiation+to+assure+cancer+prevention.">p53 is balancing development, differentiation and de-differentiation to assure cancer prevention.</a> Carcinogenesis. 31, 1501-1508 (2010).</li><li>Dickson, M. A., Schwartz, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell-cycle+inhibitors+for+cancer+therapy.">Development of cell-cycle inhibitors for cancer therapy.</a> Curr. Oncol. 16, 36-43 (2009).</li><li>Banfalvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+synchronization+of+animal+cells+and+nuclei+by+centrifugal+elutriation.">Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation.</a> Nat. Protoc. 3, 663-673 (2008).</li><li>van Opstal, A., Boonstra, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+phosphatidylinositol+3-kinase+activity+prevent+cell+cycle+progression+and+induce+apoptosis+at+the+M/G1+transition+in+CHO+cells.">Inhibitors of phosphatidylinositol 3-kinase activity prevent cell cycle progression and induce apoptosis at the M/G1 transition in CHO cells.</a> Cell Mol. Life Sci. 63, 220-228 (2006).</li><li>Gasnereau, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+to+sort+mammalian+cells+in+cytokinesis.">Flow cytometry to sort mammalian cells in cytokinesis.</a> Cytometry. A. 71, 1-7 (2007).</li><li>Harper, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+cell+populations+in+G1/S+and+G2/M+phases+of+the+cell+cycle.">Synchronization of cell populations in G1/S and G2/M phases of the cell cycle.</a> Methods Mol. Biol. 296, 157-166 (2005).</li><li>Pedrali-Noy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+HeLa+cell+cultures+by+inhibition+of+DNA+polymerase+alpha+with+aphidicolin.">Synchronization of HeLa cell cultures by inhibition of DNA polymerase alpha with aphidicolin.</a> Nucleic Acids Res. 8, 377-387 (1980).</li><li>Merrill, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+synchronization.">Cell synchronization.</a> Methods Cell Biol. 57, 229-249 (1998).</li><li>Fleisig, H. B., Wong, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+promotes+efficient+cell+cycle+kinetics+and+confers+growth+advantage+to+telomerase-negative+transformed+human+cells.">Telomerase promotes efficient cell cycle kinetics and confers growth advantage to telomerase-negative transformed human cells.</a> Oncogene. , (2011).</li><li>Cai, D., Byth, K. F., Shapiro, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AZ703,+an+imidazo[1,2-a]pyridine+inhibitor+of+cyclin-dependent+kinases+1+and+2,+induces+E2F-1-dependent+apoptosis+enhanced+by+depletion+of+cyclin-dependent+kinase+9.">AZ703, an imidazo[1,2-a]pyridine inhibitor of cyclin-dependent kinases 1 and 2, induces E2F-1-dependent apoptosis enhanced by depletion of cyclin-dependent kinase 9.</a> Cancer Res. 66, 435-444 (2006).</li><li>Pozarowski, P., Darzynkiewicz, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+cycle+by+flow+cytometry.">Analysis of cell cycle by flow cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 281, 301-311 (2004).</li><li>Sherwood, S. W., Rush, D. F., Kung, A. L., Schimke, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+B1+expression+in+HeLa+S3+cells+studied+by+flow+cytometry.">Cyclin B1 expression in HeLa S3 cells studied by flow cytometry.</a> Exp. Cell Res. 211, 275-281 (1994).</li></ol>

Grazie alla combinazione di citometria a flusso con incorporazione di BrdU, abbiamo gli strumenti necessari per studiare cinetica del ciclo cellulare. La proprietà caratteristica di BrdU per funzionare come un analogo della timidina è ciò che permette di quantificare il contenuto di DNA di una cellula bicicletta. L&#39;incorporazione di BrdU in un filamento figlia crescente DNA durante la fase di sintesi del ciclo cellulare è quello che permette di seguire una sottopopolazione di cellule bicicletta attraverso la rep...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> bromodeossiuridina </td><td> Becton Dickinson </td><td> 55089 </td><td></td></tr><tr><td> propidio ioduro </td><td> Sigma </td><td> 287075 </td><td> 1mg/ml magazzino </td></tr><tr><td> FITC anti-BrdU </td><td> Becton Dickinson </td><td> 347583 </td><td></td></tr><tr><td> di sodio tetraborato </td><td> Pescatore </td><td> S80172 </td><td> 0,1 M, pH 8,5 </td></tr><tr><td> FACS Caliber </td><td> Becton Dickinson </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measuring cell cycle progression kinetics with metabolic labeling and flow cytometry

Controllo preciso di inizio e la progressione successiva attraverso le varie fasi del ciclo cellulare sono di fondamentale importanza in cellule proliferanti. Ciclo di divisione cellulare è parte integrante della crescita e la riproduzione e deregolamentazione dei componenti chiave del ciclo cellulare sono stati implicati negli eventi scatenanti di 1,2 carcinogenesi. Agenti molecolari in terapie anti-cancro spesso bersaglio vie biologiche responsabili della regolamentazione e il coordinamento della divisione del ciclo cellulare 3. Sebbene cinetica del ciclo cellulare tendono a variare in base al tipo di cellula, la distribuzione delle celle tra le quattro fasi del ciclo cellulare è piuttosto consistente in una linea cellulare particolare grazie al modello di costante mitogeni e espressione di fattore di crescita. Eventi genotossici ed altri fattori di stress cellulare può risultare in un blocco temporaneo di progressione del ciclo cellulare, con conseguente arresto temporaneo o una pausa in una particolare fase del ciclo cellulare per consentire istituzionigazione del meccanismo di risposta adeguata. La capacità di osservare sperimentalmente il comportamento di una popolazione di cellule con riferimento alla fase progressione del ciclo cellulare è un importante progresso in biologia cellulare. Procedure comuni come mitotico scrollarsi di dosso, centrifugazione differenziale o citometria a flusso basato ordinamento vengono utilizzati per isolare le cellule in specifici momenti del ciclo cellulare 4-6. Questi frazionati, ciclo cellulare fase arricchiti popolazioni vengono poi sottoposti a trattamenti sperimentali. Resa, la purezza e la vitalità delle frazioni separate possono spesso essere compromessa usando questi metodi di separazione fisici. Inoltre, l&#39;intervallo di tempo tra la separazione delle popolazioni cellulari e l&#39;inizio del trattamento sperimentale, la quale le cellule frazionati può passare dallo stadio selezionato ciclo cellulare, può creare problemi rilevanti il ​​successo e l&#39;interpretazione di questi esperimenti. Altri approcci alla stUdy fasi del ciclo cellulare includono l&#39;uso di prodotti chimici per sincronizzare le cellule. Il trattamento delle cellule con inibitori chimici di chiave processi metabolici per ogni fase del ciclo cellulare sono utili nel bloccare la progressione del ciclo cellulare alla fase successiva. Ad esempio, i ribonucleotide reduttasi idrossiurea cellule arresta a G1 / S frangente limitando la fornitura di deossinucleotidi, i blocchi di costruzione di DNA. Altre sostanze chimiche importanti includono il trattamento con afidicolina, un inibitore di alfa polimerasi per l&#39;arresto G1, il trattamento con colchicina e nocodazole, entrambi interferire con la formazione mitotica mandrino per arrestare le cellule in fase M e, infine, il trattamento con il DNA catena terminatore 5-fluorodeoxyridine di avviare S arresto di fase 7-9. Il trattamento con queste sostanze è un mezzo efficace di sincronizzazione un&#39;intera popolazione di cellule ad una fase particolare. Con la rimozione della sostanza chimica, le cellule rientrare nel ciclo cellulare all&#39;unisono. Trattamento della seguente comunicato di prova agentedalla chimica ciclo cellulare bloccando assicura che la risposta farmaco sollecitato è da un uniforme, ciclo cellulare stadio-specifico popolazione. Tuttavia, poiché molti dei sincronizzatori chimiche sono noti composti genotossici, prendere in giro a parte la partecipazione di vari percorsi di risposta (per i sincronizzatori contro gli agenti di test) è una sfida. Qui si descrive un metodo metabolico etichettatura per seguire una sottopopolazione di cellule attivamente in bicicletta attraverso la loro progressione dalla fase di replicazione del DNA, attraverso la divisione e la separazione delle loro cellule figlie. Accoppiato con quantificazione citometria a flusso, questo protocollo permette per la misurazione della cinetica progressione del ciclo cellulare in assenza di una meccanicamente o chimicamente cellulare indotta sottolinea comunemente associati con altre metodologie ciclo cellulare di sincronizzazione 10. Nelle sezioni seguenti si discuterà la metodologia, così come alcune delle sue applicazioni nella ricerca biomedica.

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Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Monitoraggio sottili cambiamenti nella progressione e cinetica di fasi del ciclo cellulare può essere realizzata mediante l&#39;uso di una combinazione di marcatura metabolica di acidi nucleici con BrdU e DNA genomico totale colorazione tramite ioduro di propidio. Questo metodo evita la necessità di sincronizzazione chimica del ciclo cellulare, impedendo l&#39;introduzione di non-specifico danno al DNA, che a sua volta influisce progressione del ciclo cellulare.

Cella di misura Kinetics progressione del ciclo con la marcatura metabolica e citometria a flusso

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

Misurare esocitosi nei neuroni Utilizzando Etichettatura FM

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Ricerca

Biologia

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

Studiare Biogenesi della membrana con una luciferasi saggio basato su Reporter Gene

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Purificazione Citometria a flusso di cellule di topo Meiotic

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Flusso Cytometry basata Purificazione<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zigoti

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Ottimizzato Metodi di modellazione e colorazione proliferazione per il monitoraggio divisione cellulare utilizzando coloranti Tracking Cellulari

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Misurare intracellulare Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Modifiche di sperma umano utilizzando quattro tecniche: fluorometria convenzionale, si fermò fluorometria Flow, Citometria a flusso singolo e l&#39;imaging cellulare

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Metabolica Etichettatura di leucina Rich Repeat chinasi 1 e 2 con Radioactive fosfato

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Etichettatura e con membrana frazionamento per proteomica comparativa Analisi del<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Culture sospensione cellulare

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

Monitoraggio temporale del ciclo cellulare progressione citometria a flusso, senza la necessità di sincronizzazione

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Thermo flusso LED - La combinazione Optogenetics con citometria a flusso

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...