Name: measuring cell cycle progression kinetics with metabolic labeling and flow cytometry
Uploaded: 2012-05-22T13:00:00
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我々はFACS分析の支援についてはUBCで医学研究センターのアンディ·ジョンソンに感謝します。ウォン研究所のがん研究の資金は、カナダの癌協会総合研究所（オペレーティング·グラント＃019250）でと薬学、UBCの学部の研究再投資資金から提供されています。 JMYWは、カナダリサーチチェアと保健研究キャリア開発プログラムのマイケル·スミス財団によってサポートされています。

1。細胞調製<img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig0.jpg" alt="図0" /> <ol><li>約60％コンフルエント?...

<ol>
	<li>Musgrove, E. A., Caldon, C. E., Barraclough, J., Stone, A., Sutherland, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+D+as+a+therapeutic+target+in+cancer.">Cyclin D as a therapeutic target in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 11, 558-572 (2011).</li><li>Molchadsky, A., Rivlin, N., Brosh, R., Rotter, V., Sarig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+is+balancing+development,+differentiation+and+de-differentiation+to+assure+cancer+prevention.">p53 is balancing development, differentiation and de-differentiation to assure cancer prevention.</a> Carcinogenesis. 31, 1501-1508 (2010).</li><li>Dickson, M. A., Schwartz, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell-cycle+inhibitors+for+cancer+therapy.">Development of cell-cycle inhibitors for cancer therapy.</a> Curr. Oncol. 16, 36-43 (2009).</li><li>Banfalvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+synchronization+of+animal+cells+and+nuclei+by+centrifugal+elutriation.">Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation.</a> Nat. Protoc. 3, 663-673 (2008).</li><li>van Opstal, A., Boonstra, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+phosphatidylinositol+3-kinase+activity+prevent+cell+cycle+progression+and+induce+apoptosis+at+the+M/G1+transition+in+CHO+cells.">Inhibitors of phosphatidylinositol 3-kinase activity prevent cell cycle progression and induce apoptosis at the M/G1 transition in CHO cells.</a> Cell Mol. Life Sci. 63, 220-228 (2006).</li><li>Gasnereau, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+to+sort+mammalian+cells+in+cytokinesis.">Flow cytometry to sort mammalian cells in cytokinesis.</a> Cytometry. A. 71, 1-7 (2007).</li><li>Harper, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+cell+populations+in+G1/S+and+G2/M+phases+of+the+cell+cycle.">Synchronization of cell populations in G1/S and G2/M phases of the cell cycle.</a> Methods Mol. Biol. 296, 157-166 (2005).</li><li>Pedrali-Noy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+HeLa+cell+cultures+by+inhibition+of+DNA+polymerase+alpha+with+aphidicolin.">Synchronization of HeLa cell cultures by inhibition of DNA polymerase alpha with aphidicolin.</a> Nucleic Acids Res. 8, 377-387 (1980).</li><li>Merrill, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+synchronization.">Cell synchronization.</a> Methods Cell Biol. 57, 229-249 (1998).</li><li>Fleisig, H. B., Wong, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+promotes+efficient+cell+cycle+kinetics+and+confers+growth+advantage+to+telomerase-negative+transformed+human+cells.">Telomerase promotes efficient cell cycle kinetics and confers growth advantage to telomerase-negative transformed human cells.</a> Oncogene. , (2011).</li><li>Cai, D., Byth, K. F., Shapiro, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AZ703,+an+imidazo[1,2-a]pyridine+inhibitor+of+cyclin-dependent+kinases+1+and+2,+induces+E2F-1-dependent+apoptosis+enhanced+by+depletion+of+cyclin-dependent+kinase+9.">AZ703, an imidazo[1,2-a]pyridine inhibitor of cyclin-dependent kinases 1 and 2, induces E2F-1-dependent apoptosis enhanced by depletion of cyclin-dependent kinase 9.</a> Cancer Res. 66, 435-444 (2006).</li><li>Pozarowski, P., Darzynkiewicz, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+cycle+by+flow+cytometry.">Analysis of cell cycle by flow cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 281, 301-311 (2004).</li><li>Sherwood, S. W., Rush, D. F., Kung, A. L., Schimke, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+B1+expression+in+HeLa+S3+cells+studied+by+flow+cytometry.">Cyclin B1 expression in HeLa S3 cells studied by flow cytometry.</a> Exp. Cell Res. 211, 275-281 (1994).</li></ol>

BrdUの取り込みをフローサイトメトリーを組み合わせることにより、我々は細胞周期動態を検討するために必要なツールを持っています。チミジンのアナログとして機能するBrdUの独特のプロパティは、サイクリング細胞のDNA含量の定量を可能にするものです。細胞周期の合成フェーズで成長娘DNA鎖へのBrdUの取り込みは1つがG2での成長期に、最終的に細胞分裂に、S期におけるDNAの複製を介し?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>ブロモデオキシウリジン</td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> 55089 </td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>シグマ</td><td> 287075 </td><td> 1mg/ml株式</td></tr><tr><td> FITC標識抗BrdU </td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> 347583 </td><td></td></tr><tr><td>四ホウ酸ナトリウム</td><td>フィッシャー</td><td> S80172 </td><td> 0.1M、pH 8.5の</td></tr><tr><td> FACSキャリバー</td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measuring cell cycle progression kinetics with metabolic labeling and flow cytometry

細胞周期のさまざまな段階を経て開始とその後の進行の正確な制御は、細胞の増殖に極めて重要である。細胞周期の分裂は、成長と重要な細胞周期成分の再現性と規制緩和が発癌1,2の沈殿イベントに関与しているの不可欠な部分です。抗がん治療における分子のエージェントが頻繁に細胞周期の分裂3の規制と調整を担当生物学的経路を対象としています。細胞周期動態は細胞の種類に応じて変化する傾向があるが、細胞周期の4つの段階の中の細胞の分布は、マイトジェン、成長因子の発現の一貫したパ​​ターンに起因する特定の細胞株内ではなく、一貫性があります。遺伝毒性のイベントや他の細胞ストレスがinstiを可能にするために逮捕されたり、特定の細胞周期フェーズの一時的なポーズ、その結果、細胞周期の進行を一時的にブロックになることが適切な応答機構のgation。 実験的にそれらの細胞周期の進行の段階への参照を使用して、細胞集団の振る舞い​​を観察する能力は、細胞生物学における重要な前進である。そのような細胞分裂などの一般的な手順は、細胞周期4-6の特定の段階で細胞を単離するために使用され、分画遠心法またはフローサイトメトリーベースのソートを振り払う。これらを分画し、細胞周期相濃縮集団はその後、実験的な治療に供される。区切られた画分の収量、純度、生存率は、しばしば、これらの物理的な分離メソッドを使用して、妥協することができます。同様に、細胞集団の分離分画した細胞が選択された細胞周期の段階から進行することができる実験的な治療の開始の間の時間経過は、実装を成功させると、これらの実験の解釈に重要な課題を提起することができます。 STに他のアプローチUDY細胞周期の段階は、細胞を同期させる化学物質の使用が含まれています。各細胞周期ステージのための鍵となる代謝プロセスの化学的阻害剤による細胞の処理は、次の段階に細胞周期の進行を阻止するのに有用である。デオキシヌクレオチド、DNAのビルディングブロックの供給を制限することにより、G1 / S時点で、例えば、リボヌクレオチド還元酵素阻害剤ヒドロキシウレアを停止した細胞。他の顕著な化学物質がアフィジコリンによる治療を含む、有糸分裂紡錘体の形成を妨げるどちらもG1停止のためのポリメラーゼα阻害剤、コルヒチンとノコダゾールによる治療は、M期​​で細胞を停止し、最終的に、DNA鎖ターミネーター5 fluorodeoxyridineによる治療が開始するS期停止7-9これらの化学物質による治療は、特定の段階で細胞の全人口を同期させる有効な手段である。化学物質の除去と、細胞が一斉に細胞周期に復帰。テストエージェントは、次のリリースの治療細胞周期阻止化学物質から誘発される薬物反応が均一で、細胞周期ステージ特定の集団からのものであることを保証します。しかし、化学シンクロナイザの多くのため、挑戦している様々な応答経路（テストエージェント対シンクロナイザまで）の参加を離れてからかう、遺伝毒性の化合物が知られている。 ここでは、彼らの娘細胞の分裂と分離に至るまで、積極的にDNA複製の段階からその進行を介して細胞を自転車の集団を以下の代謝標識法を説明します。フローサイトメトリーの定量化と相まって、このプロトコルのいずれかを機械的または化学的に誘導され、携帯は一般的に他の10の細胞周期の同期化の方法論に関連付けられているストレスの存在下で細胞周期の進行運動を測定するために有効になります。以下のセクションでは、方法論だけでなく、生物医学研究への応用のいくつかを説明します。

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Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

細胞周期ステージの進行と動態の追跡微妙な変化は、BrdUとヨウ化プロピジウムを経由して全ゲノムDNAを染色した核酸の代謝標識の組み合わせの使用によって達成することができます。このメソッドは、それによって順番に細胞周期の進行に影響を及ぼす非特異的DNA損傷の導入を防止し、サイクリング細胞の化学物質の同期の必要がなくなります。

代謝標識とフローサイトメトリーで細胞周期の進行速度を測定

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

FMラベリングを用いた神経細胞の測定エキソサイトーシス

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

生物学

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

ルシフェラーゼベースのレポーター遺伝子アッセイで膜の生合成を研究して

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

マウス減数分裂細胞のフローサイトメトリーの精製

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

のフローサイトメトリーベースの精製<em&gt; S.セレビ</em&gt;受精卵

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

細胞トラッキング染料を使用して細胞分裂監視のための最適化された染色と増殖モデリング方法

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

細胞内Ca測定<sup&gt; 2 +</sup4つの方法を使用して人間の精子で&gt;変更：従来の蛍光測定、停止フロー蛍光法、フローサイトメトリーおよび単一細胞イメージング

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

ロイシンリッチの代謝標識は、放射性リン酸キナーゼ1および2を繰り返します

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

比較プロテオーム解析のための代謝標識および膜分画<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;サスペンション細胞培養

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

同期を必要とせずに、フローサイトメトリーを用いた細胞周期の進行の時間追跡

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

LEDサーモフロー - フローサイトメトリーで光遺伝学を組み合わせます

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...