Name: a parasite rescue and transformation assay for antileishmanial screening against intracellular leishmania donovani amastigotes in thp1 human acute monocytic leukemia cell line
Uploaded: 2012-12-30T12:00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic L

الاتفاق العلمية نسنبر-USDA-ARS رقم 58-6408-2-0009؛ CDMRP منحة جائزة # W81XWH-09-2-0093 عن طريق البحث الطبي التابع للجيش الأميركي وقيادة العتاد.

1. صيانة وثقافة ثانوية THP1 زراعة الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على THP1 الخلايا في المتوسط ​​RPMI-1640 (FBS مع 10٪ ودرجة الحموضة 7.4) في C ° 37 في حاضنة 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة فرعية الخلايا مرتين في الأسبوع لمنع خلايا من تجاوز 1x10 6 خلايا / مل. هذا مهم للحفاظ على قدرتها التحول. </li></ol> 2. صيانة وثقافة ثانوية الليشمانيا الدونوفانية الثقافة Promastigotes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على L. الدونوفانية promastigotes (S1، السودان سلالة) في RPMI-1640 متوسطة (بدون بيكربونات الصوديوم والصوديوم البيروفات) مع FBS 10٪ عند 26 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة فرعية L. الدونوفانية promastigotes مرتين في الأسبوع، مع تركيز أعلى الخلايا في نطاق promastigotes 6 20-25x10 / ml.Caution: يجب تقديم جميع وسائل الإعلام وحلول لدرجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. </li></ol> 3. البذر وتمايز الخلايا THP1 في ج 96 صفيحة ميكروسكوبية جيدا و16-غرفة الشرائح الثقافة الزجاج. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المخفف THP1 الثقافة مع عدد خلايا من الخلايا 5 2.5x10 / مل من ثقافة الخلية أربعة أيام من العمر (عدد خلايا يجب أن لا تتجاوز 10 6 خلية / مل) في RPMI-1640 مع FBS المعطل للحرارة بنسبة 10٪. أعدت 20 مل من ثقافة كل لوحة 96-4 مل بشكل جيد والثقافة لكل شريحة الدائرة 16-أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة phorbol 12-13-ميريستات خلات (PMA) (للتمايز THP1) إلى الخلية المخففة التعليق الثقافة (10 مل الثقافة μl/20 من المخزون من 50 ميكروغرام / مل في DMSO) (PMA النهائي تركيز الخلايا في الثقافة يجب أن تكون مخففة 25 نانوغرام / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للمقارنة بين صورة الرقمية تحليل المباشر العد والفحص الطفيلي الإنقاذ فإن التحول الفحص، إعداد المقايسات في وقت واحد في واضحة، مسطحة القاع لوحة 96-حسنا، و 16 غرفة، والزجاج والمجهرية الشريحة الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء 200 ميكرولتر من الخلايا THP1-PMA المعاملة لكل بئر أو الدائرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان ع 96-جيداالمرحومين والشرائح غرفة 16-C بشكل جيد في درجة 37، 5٪ CO 2 حاضنة ليلة وضحاها للسماح التمايز شبه كامل للخلايا. </li></ol> ملاحظة: يتم التمييز الخلايا THP1، التي تنمو عادة في التعليق، في الضامة ملتصقة. 4. إصابة الخلايا THP1 تحولت مع Promastigotes الدونوفانية الليشمانيا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإصابة خلية ثقافة متباينة THP1 مع promastigotes الدونوفانية الليشمانيا، ينبغي أن يكون غالبية الطفيليات المعدية في مرحلة metacyclic (أشكال اسطوانية طويلة، ~ 5-6 يوم الثقافة القديمة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> A 1:10 THP1 الخلية إلى نسبة الطفيلي هو الأمثل لإصابة في كل من الفحص الرقمي، صورة التحليل المباشر العد والمشيقة الإنقاذ فإن التحول الفحص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ثقافة المخففة للL. الدونوفانية promastigotes مع عدد الطفيليات رقم 6 من الطفيليات 2.5x10 / مل (للTHP1 الخلايا: = نسبة الطفيليات 1:10) منثقافة 5-6 أيام من العمر في المتوسط ​​RPMI-1640 مع 2٪ FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من الخطوة 3.5 (بعد التمايز بين عشية وضحاها من زراعة الخلايا THP1) إخراج لوحات الشرائح وغرفة، وإزالة المتوسطة وغسل مزارع الخلايا مرة واحدة مع المصل خالية متوسطة RPMI-1640. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل دقيق للتعامل PMA-THP1 الخلايا مع المصل خالية، دافئة RPMI-1640 (~ 37 درجة مئوية) المتوسط، استبدال المتوسطة المصل خالية مع 200 ميكرولتر من ثقافة المخففة للL. الدونوفانية promastigotes (2.5x10 6 الطفيليات / مل) من الخطوة 4.3. إعداد السيطرة على آبار THP1 الخلايا دون الطفيلي والطفيليات والخلايا دون THP1 في كل لوحة والشرائح غرفة 16-أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إضافة الطفيلي إلى زراعة الخلايا THP1، احتضان لوحة الشرائح وعند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة للسماح للطفيليات لتصيب الخلايا المتمايزة THP1. </li></ol> 5. علاج الضامة المصابة مع أدوية اختبار / مركبات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختبارالأمفوتريسين B، البنتاميدين وMiltefosine والعقاقير المضادة لليشماني القياسية للفحص. إعداد حلول الأسهم من المخدرات / مركبات اختبار في الماء أو DMSO كما هو مذكور في الجدول كاشف. اختبار كل مركب المخدرات في 6 تجمعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخفيف متسلسل (1:5) على العقاقير القياسية ومركبات الاختبار في لوحة جديدة 96-جيدا أو 2 مل أنابيب (للشرائح غرفة) مع المتوسط ​​RPMI-1640 مع 2٪ FBS. المخدرات / تركيزات المركب في هذا الاختبار هي لوحة 2X تركيزات النهائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل الصحون الثقافة والشرائح غرفة المصابين L. promastigotes الدونوفانية (من الخطوة 4.5) على الأقل 5 مرات مع المصل خالية متوسطة RPMI-1640. إضافة 100 ميكرولتر المتوسطة الثقافة (RPMI-1640 مع 2٪ FBS) في كل بئر / غرفة. والغسيل متعددة ضرورية لضمان إزالة كاملة من غير المنضوية promastigotes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من المتوسطة متسلسل-المخفف العقاقير المضادة لليشماني القياسية أو مركبات الاختبار لكل بئر أو الدائرة. إعداد العدوىتيد الخلايا THP1 تسيطر المخدرات دون وقت واحد في كل شريحة لوحة / غرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات الشرائح وغرفة في 37 ° C، 5٪ CO 2 لمدة 48 ساعة. </li></ol> 6. غرفة تلوين الشرائح، التصوير مجهر نيون وتحليل الصور لالكمي لتأثير العدوى والعلاج الدوائي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 48 ساعة حضانة، وغسل الشريحة غرفة 3 مرات مع المصل خالية متوسطة RPMI-1640. انزع الدوائر من البلاستيك الشرائح وتحديد الخلايا عن طريق غمر الشرائح في الميثانول لمدة 30 ثانية. ترك الشرائح في الحيوية تحت غطاء محرك السيارة تدفق الهواء لتجفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الأخضر SYBR حل تلطيخ I (5X) من خلال تمييع (1:2،000) السهم (10،000 X) مع الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار الشرائح في ظل ظروف مظلمة مع الأخضر المخفف SYBR I صمة عار حل لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وغسل مرة واحدة مع الماء ويترك الشرائح تحت تدفق الهواء لتجفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع ساترة الزجاج الكاملة على staiNED الشريحة بمساعدة المتوسطة المتزايدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط الصور الرقمية من خلايا THP1: دون العدوى (فارغة)، مع إصابة (التحكم)، الخلايا المصابة تعامل مع الأدوية القياسية المختلفة أو مركبات اختبار في التخفيفات مختلفة (الشكل 3 و 5 و 6)) باستخدام مجهر نيكون الكسوف 90i الفلورسنت رافق بواسطة NIS البرمجيات عنصر 3،2 AR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد نوى البلاعم (كبيرة) ونواة الطفيلي (صغير مع منشأ الحركة) باستخدام يماغيج (الشكل 7)، والذي هو علنا المتاحة، ومعالجة الصور برنامج جافا القائمة المتقدمة في المعاهد الوطنية للصحة ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">http://rsb. info.nih.gov / ط / download.html</a> ). تعبر عن البيانات حيث وصل عدد amastigotes لكل 100 THP1 تحول الخلايا. </li></ol> 7. الطفيلي الإنقاذ فإن التحول-الفحص: تحلل من الشواهد L. الدونوفانية Amastigotes الضامة المصابة<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل صفيحة ميكروسكوبية 96-جيدا من الخطوة 5.5 مع المصل ثلاث مرات خالية RPMI-1640 متوسطة الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بين مختلف المنظفات اختبار بتركيزات مختلفة، 0.05٪ SDS العلاج لمدة 30 ثانية هو الأمثل للتحلل للرقابة (الحد الأقصى تحلل الخلايا مع فقدان الحد الأدنى من السلامة الطفيليات انقاذ &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة المصل خالية من كل بئر بعد غسل الماضي، وإضافة 20 ميكرولتر من RPMI-1640 (0.05٪ مع SDS) إلى كل بئر. يهز لوحة لمدة 30 ثانية وإضافة 180 كاملة ميكرولتر RPMI-1640 (FBS مع 10٪) إلى كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات في C ° 26 لمدة 48 ساعة لتحويل amastigotes انقاذ لpromastigotes. </li></ol> 8. التحليل الكمي من المشيقة المحولة (alamarBlue الفحص) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 48 ساعة حضانة في 26 ° C، يتم تحويل كافة amastigotes انقاذ الحية في promastigotes (1D الشكل). إضافة 10 ميكرولتر من كل بئر إلى alamarBlue من ص 96-جيداالمرحومين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات عند 26 درجة مئوية خلال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد مرور فترة الحضانة بين عشية وضحاها، وقراءة لوحات لمضان القياسية على مقياس التألق غالاكسي Fluostar (BMG مختبر تكنولوجيا) في الإثارة نانومتر 544، 590nm الانبعاثات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد منحنيات الاستجابة للجرعة (في المئة مقابل نمو تركيز مركب المخدرات أو اختبار) مع ExcelFit (أرقام 7-9) وحساب IC 50/90 IC القيم من هذه المنحنيات (الجدول 1). </li></ol> 9. توحيد THP1 خلايا لنسبة الطفيليات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توحيد الخلايا THP1 إلى نسبة الطفيليات لتحديد حساسية الفحص. ملاحظة: العدوى منخفض / عاليا الطفيليات أرقام / قد حل وسط مع الحساسية والانتقائية للفحص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توحيد الخلايا THP1 إلى نسبة الطفيليات باتباع البروتوكول المذكورة أعلاه للبذار والليشمانيا الخلايا THP1 العدوى المشيقة (القسم 3 و 4) فرق باستثناء استخدامerent نسب THP1 خلايا للطفيليات و1:1.25، 1:5، 1:2.5 و1:10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد التجربة سواء في غرفة 16-الشريحة (لتحليل الصور) وكذلك 96-وحة (لطفيل الإنقاذ مقايسة) أشكال للمقارنة بين الطفيلي والإنقاذ المقايسات تحليل الصور. </li></ol> 10. توحيد المنظفات المختلفة للتحلل الخلايا تسيطر عليها <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> والهدف الرئيسي من هذه التجربة هو لتحسين بروتوكول للرقابة تحلل الخلايا THP1 لتحقيق أقصى قدر من / تحلل الخلايا كاملة دون أن يؤثر ذلك بشكل كبير THP1 جدوى ليشمانة الطفيليات انقاذهم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختبار المنظفات المختلفة مثل توين 20، توين 80، تريتون X-100، 40-NP وSDS بتركيزات مختلفة وفترات مختلفة من العلاج (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> THP1 الخلايا لنسبة الطفيليات هو 1:10 و غيرها من الشروط هي مماثلة لأقسام أعلاه 1-8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختبار العلاج SDS 0.05٪ لمزيد من الوقت معاملة مختلفةليالي لمزيد من تحسين تحلل الخلايا التي تسيطر عليها. </li></ol>

<ol>
	<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Control of the leishmaniasis: report of a meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniasis. Xii, 22-26 (2010).</li><li>Croft, S. L., Seifert, K., Yardley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+scenario+of+drug+development+for+leishmaniasis.">Current scenario of drug development for leishmaniasis.</a> Indian J. Med. Res. 123 (3), 399-410 (2006).</li><li>Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Resistance+in+Leishmaniasis.">Drug Resistance in Leishmaniasis.</a> Clinical Microbiology reviews. 19 (1), 111-126 (2006).</li><li>Mikus, J., Steverding, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+colorimetric+method+to+screen+drug+cytotoxicity+against+Leishmania+using+the+dye+AlamarBlue.">A simple colorimetric method to screen drug cytotoxicity against Leishmania using the dye AlamarBlue.</a> Parasitology International. 48 (3), 265-269 (2000).</li><li>Callahan, H. L., Portal, A. C., Devereaux, R., Grogl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Axenic+Amastigote+System+for+Drug+Screening.">An Axenic Amastigote System for Drug Screening.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 41 (4), 818-822 (1997).</li><li>Seifert, K., Escobar, P., Croft, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+activity+of+anti-leishmanial+drugs+against+Leishmania+donovani+is+host+cell+dependent.">In vitro activity of anti-leishmanial drugs against Leishmania donovani is host cell dependent.</a> J. Antimicrob. Chemother. 65 (3), 508-511 (2010).</li><li>Kolodziej, H., Kiderlen, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antileishmanial+activity+and+immune+modulatory+effects+of+tannins+and+related+compounds+on+Leishmania+parasitized+RAW+264.7+cells.">Antileishmanial activity and immune modulatory effects of tannins and related compounds on Leishmania parasitized RAW 264.7 cells.</a> Phytochemistry. 66 (17), 2056-2071 (2005).</li><li>Maia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectivity+of+five+different+types+of+macrophages+by+Leishmania+infantum.">Infectivity of five different types of macrophages by Leishmania infantum.</a> Acta Tropica. 103 (2), 150-155 (2007).</li><li>Neal, R. A., Croft, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+system+for+determining+the+activity+of+compounds+against+the+intracellular+amastigote+form+of+Leishmania+donovani.">An in vitro system for determining the activity of compounds against the intracellular amastigote form of Leishmania donovani.</a> J. Antimicrob. Chemother. 14, 463-475 (1984).</li><li>Abdullah, S. M., Flath, B., Presber, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+staining+procedures+for+the+flow+cytometric+analysis+of+U-937+cells+infected+with+different+Leishmania-species.">Comparison of different staining procedures for the flow cytometric analysis of U-937 cells infected with different Leishmania-species.</a> J. Microbiol Methods. 37 (2), 123-138 (1999).</li><li>Giorgio, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometric+Detection+of+Leishmania+Parasites+in+Human+Monocyte-Derived+Macrophages:+Application+to+Antileishmanial-Drug+Testing.">Flow Cytometric Detection of Leishmania Parasites in Human Monocyte-Derived Macrophages: Application to Antileishmanial-Drug Testing.</a> Antimicrob Agents Chemother. 44 (11), 3074-3078 (2000).</li><li>Mandal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+of+Leishmania+donovani+clinical+isolates+against+drug+using+a+colorimetric+&#946;+Lactamase+assay.">High throughput screening of Leishmania donovani clinical isolates against drug using a colorimetric &#946; Lactamase assay.</a> Indian J. Exp. Biol. 47 (6), 475-479 (2009).</li><li>Chan, M. M. Y., Bulinski, J. C., Chang, K. P., Fong, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+assay+for+Leishmania+amazonensis+promastigotes+expressing+multimeric+green+fluorescent+protein.">Microplate assay for Leishmania amazonensis promastigotes expressing multimeric green fluorescent protein.</a> Parasitol. Res. 89 (4), 266-271 (2003).</li><li>Buckner, F. S., Wilson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+assay+for+screening+compounds+against+Leishmania+Amastigote+Grown+in+macrophages.">Colorimetric assay for screening compounds against Leishmania Amastigote Grown in macrophages.</a> Am. J. Trop. Med. 72 (5), 600-605 (2005).</li><li>Sereno, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+perspectives+in+Leishmania+cell+based+drug-screening+procedures.">Advances and perspectives in Leishmania cell based drug-screening procedures.</a> Parasitol. Int. 56 (1), 3-7 (2007).</li><li>Gupta, S., Nishi, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visceral+leishmaniasis:+experimental+models+for+drug+discovery.">Visceral leishmaniasis: experimental models for drug discovery.</a> Indian J. Med. Res. 133, 27-39 (2011).</li><li>Roy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Episomal+and+stable+expression+of+the+luciferase+reporter+gene+for+quantifying+Leishmania+spp.+Infections+in+macrophages+and+in+animal+models.">Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. Infections in macrophages and in animal models.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 110 (2), 195-206 (2000).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

هناك العديد من الطرق المتاحة لفحص المخدرات المضادة لليشماني يعتمد على البلاعم، ليشمانة النماذج. ويمكن أن يتم المقايسات مع الضامة التي تم جمعها من الحيوانات المضيفة الخلايا الافرازات البريتوني وهي (PEC)، وخلايا الدم الطرفية الوحيدات (PBMC) 6 أو نخاع العظام المستمدة الضامة (BMM) أو في خطوط الخلايا الوحيدات مثل الماوس (J774 وRAW264.7 ) 7 والبشرية (THP1، U937، HL-60) 8 خلايا الوحيدات. يجب أن المقايسات، والتي تستخدم تقسيم الخلايا المضيفة، وضمان أن يتم النظر في الآثار التباس النشاط المخدرات على كل من الطفيليات والخلايا المضيفة عدد. الضامة متباينة الأولية التي تم جمعها من مصادر مختلفة مثل الفئران والجرذان هي غير الفاصل في الطبيعة، ولكن هذه الاستعدادات قد لا يكون خلية خلية متجانسة السكان. خطوط الخلايا خلايا الوحيدات المستمدة متجانسة في طبيعتها، والتي تعتبر أفضل نموذج للفحص ليشمانة البلاعم-مقرا لها. من مختلف خطوط الخلايا الوحيدات، diffeيمكن rentiated THP1 الخلايا (خلايا سرطان الدم الحاد الإنسان الوحيدات الخط) تشكيل أحادي الطبقة غير تقسيم ويقدم بديلا جذابا لالضامة معزولة الأولية. ويمكن أن يتم فحص البلاعم ليشمانة-القائم في عدة طرق. التقييم المجهري الكلاسيكية يعتمد على خلية الطفيل العد المباشر و9 هو كثيفة العمالة. غياب الأتمتة يحد من فائدة هذا الفحص. عد الخلايا تستغرق وقتا طويلا، وربما إعطاء تقرير غير دقيق عن القيم 50 IC منذ تحديد الجدوى الطفيلي من خلال إجراء تلطيخ أمر صعب. يمكن استخدام العديد من الأصباغ الفلورية والاجسام المضادة للفحوصات تدفق cytometric 10 و 11، لكنها محدودة أيضا هذه المقايسات بسبب حساسية أقل والحد من الفترة الزمنية للعلاج المخدرات ليوم واحد فقط. هناك عدة فحوصات الجينات مراسل المتاحة لقياس نمو الخلايا amastigotes 12،13،14. والآليقد يكون من الممكن فحص إد باستخدام الجينات مراسل، ولكن هذه المقايسات أيضا بعض العوائق. أولا، معظم هذه المقايسات تتطلب انتقاء الأدوية للحفاظ على التعبير episomal من الجينات مراسل، والتي قد لا تكون مثالية لتجربة المخدرات الفرز. يمكن أن الطريقة التي يتم من خلالها عرض الجينات مراسل تؤثر أيضا على خصائص الفسيولوجية للطفيل ويكون لها تأثير على الفحص. إذا كان الجين هو مراسل جزء من البلازميد episomal، قد خرج النسبية لمراسل تعتمد على عدد نسخة من البلازميد بالنقل (والذي يختلف من خلية إلى أخرى) بدلا من التركيز على نشاط المخدرات 14. بعض الطفيليات التي تتحول مراسل الطفيليات لا تحتاج الضغط الانتقائي للحفاظ على الجينات مراسل، ولكن يمكن أن يكون هناك العواقب البيولوجية إما عن طريق تعطيل البنية الجينية أو فقط من خلال وجود البروتينات مراسل الأجنبية 15. في بعض المقايسات الجينات مراسل القائمة، وهناكالقضايا حساسية النشاط والخلفية 16. الأهم من ذلك، فإن العديد من المقايسات مراسل التعبير الجيني، وخاصة مع مراسل واحد GFP gene15، لا يفرق بين الخلايا وamastigotes الحية والميتة. قد يعتمد على الجينات المقايسات مراسل وسيفيراز التمييز بين الخلايا الحية والميتة amastigotes، ولكن الركيزة وتحلل الخلية العازلة لهذه القياسات ليست مكلفة على نطاق واسع الفحص 17. للتغلب على هذه العيوب والقيود المفروضة على فحوصات الفرز السابقة، البلاعم ليشمانة القائم، وقد وضعنا هذا الاختبار الأمثل والطفيليات الإنقاذ والتحول. ويستند هذا الفحص على THP1 الخلايا، التي لديها تجانس جيدة وغير قابلة للتقسيم في الطبيعة، والخلايا المضيفة. الفحص الطفيلي الإنقاذ فإن التحول-الفحص الموصوفة هنا هو مقارنة لفحص يعتمد على الصورة الرقمية لتحليل العد المباشر للamastigotes داخل الخلايا. الفلورسنت وDIC المجهر، ايماج الرقميةوقد المكرر ه من التحليلات ليماغيج الفرق العد والفرز لنواة ونواة البلاعم الطفيلي مزيد من الفحص المجهري العد. التقاط الصور تحت ضوء الفلورسنت الفلاتر والفرق المقابل تدخل (DIC) مرشحات تحسنت جودة الصورة الرقمية للفرز أكثر دقة من الطفيليات داخل الخلايا. يمكن دمجها كل الصور الفلورسنت ومدينة دبي للإنترنت للحصول على الصور الرقمية مع الخطوط العريضة واضحة خلية البلاعم والخلايا نوى الفلورسنت. يمكن نواة البلاعم ونواة الطفيلي يعترف تفاضلي مع يماغيج. لذلك، على حد سواء الرقمية صورة التحليل المباشر العد والفحص الطفيلي الإنقاذ فإن التحول الفحص، لديها القدرة اللازمة لأتمتة والتطبيق على نطاق واسع الفرز. الخطوات الحاسمة في الطفيل الإنقاذ، فإن التحول الفحص هي: (أ) الغسيل المتكرر لمزارع الخلايا بعد التعرض لTHP1 promastigotes الليشمانيا، لضمان إزالة كاملة تقريبا من غير متدربalized promastigotes و (ب) تحلل الخلايا تسيطر THP1 المصابة مع SDS. ويجوز لكل من الخطوات أيضا يمكن السيطرة عليها مع الأتمتة ويجب أن لا حل وسط مع الإنتاجية للمقايسة. الخطوة الثانية من الغسيل، بعد التعرض للإصابة خلايا الليشمانيا THP1 للعقاقير اختبار / مركبات يزيل ما تبقى من غير المنضوية الطفيليات، إن وجدت. الطفيلي الإنقاذ فإن التحول-الفحص يوفر مزايا هامة على القائمة المجهرية جينات مراسل، والمقايسات تحليل الصور. الفحص بسيط وقوية، وقابلة للتكرار، ويمكن أن يكون آليا لفحص واسعة النطاق، وبالتالي ينبغي أن يكون التطبيق هاما في فحص المركبات مكتبات كبيرة لاكتشاف جديد للأدوية المضادة لليشماني. مزيد، ويمكن أيضا أن تطبق الفحص لتقييم العدوى السريرية، وكذلك، العزلات مختبر الليشمانيا في المختبر.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> Phorbol 12-13-ميريستيت خلات (PMA) </td><td> سيغما الدريخ USA </td><td> P1585 </td><td> اللازمة لتمايز الخلايا THP1. </td></tr><tr><td> RPMI-1640 متوسطة </td><td> إينفيتروجن </td><td> 23400021 </td><td></td></tr><tr><td> مختبر تيك نظام الشرائح غرفة (16 غرفة) </td><td> الحرارية العلمية نونك </td><td> 178599 </td><td></td></tr><tr><td> واضحة، مسطحة القاع، 96-وحات جيدة </td><td> BD الصقر </td><td> 353075 </td><td> لوحات لأداء جيدا 96-مقايسة لوحة </td></tr><tr><td> الأمفوتريسين B </td><td> سيغما الدريخ USA </td><td> A4888 </td><td> معيار مكافحة المخدرات يشماني تذوب في DMSO (2 ملغ / مل) </td></tr><tr><td> البنتاميدين Isothionate ساLT </td><td> سيغما الدريخ USA </td><td> P 0547 </td><td> معيار مكافحة المخدرات يشماني تذوب في DMSO (2 ملغ / مل) </td></tr><tr><td> Miltefosine </td><td> EMD العلوم البيولوجية USA </td><td> 475841 </td><td> معيار مكافحة المخدرات يشماني تذوب في مصل خالية المتوسطة RPMI-1640 (إعداد جديدة) (2 ملغ / مل) </td></tr><tr><td> ستيبوغلوكونات الصوديوم </td><td> EMD العلوم البيولوجية USA </td><td> 567565 </td><td> معيار مكافحة المخدرات يشماني إعداد في RPMI-1640 مع FBS 4٪. (1 ملغ / مل) </td></tr><tr><td> كبريتات الصوديوم دوديسيل </td><td> سيغما الدريخ USA </td><td> L 5750 </td><td></td></tr><tr><td> مضان المجهر </td><td> NIKON </td><td> ECLIPSE 90i </td><td></td></tr><tr><td> مضان صفيحة ميكروسكوبية قارئ </td><td> BMG </td><td> القطبية ستار غالاكسي </td><td></td></tr><tr><td> تصاعد متوسطة </td><td> سيغما الدريخ USA </td><td> M 1289 </td><td></td></tr><tr><td> لlamarBlue </td><td> عبد Serotec </td><td> BUF012 B </td><td></td></tr><tr><td> SYBR الخضراء I </td><td> سيغما الدريخ USA </td><td> S 9430 </td><td></td></tr><tr><td> بيكربونات الصوديوم </td><td> فيشر العلوم. </td><td> 523500 </td><td></td></tr><tr><td> البيروفات الصوديوم </td><td> سيغما الدريخ USA </td><td> P2256 </td><td></td></tr><tr><td> 2-المركابتويثانول </td><td> سيغما الدريخ USA </td><td> M6250 </td><td></td></tr><tr><td> المصل البقري الجنين </td><td> أتلانتا الحيوية </td><td> S11050H </td><td></td></tr><tr><td> توين 20 </td><td> سيغما الدريخ USA </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> توين 80 </td><td> سيغما الدريخ USA </td><td> P6474 </td><td></td></tr><tr><td> تريتون X-100 </td><td> سيغما الدريخ USA </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> NP-40 </td><td> Calbiochem </tد&gt; <td> 492016 </td><td></td></tr></tbody></table>

a parasite rescue and transformation assay for antileishmanial screening against intracellular leishmania donovani amastigotes in thp1 human acute monocytic leukemia cell line

Leishmaniasis is one of the world's most neglected diseases, largely affecting the poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million people are considered at risk of contracting leishmaniasis, and approximately 2 million new cases occur yearly1. Leishmania donovani is the causative agent for visceral leishmaniasis (VL), the most fatal form of the disease. The choice of drugs available to treat leishmaniasis is limited 2;current treatments provide limited efficacy and many are toxic at therapeutic doses. In addition, most of the first line treatment drugs have already lost their utility due to increasing multiple drug resistance 3. The current pipeline of anti-leishmanial drugs is also severely depleted. Sustained efforts are needed to enrich a new anti-leishmanial drug discovery pipeline, and this endeavor relies on the availability of suitable in vitro screening models.
In vitro promastigotes 4 and axenic amastigotes assays5 are primarily used for anti-leishmanial drug screening however, may not be appropriate due to significant cellular, physiological, biochemical and molecular differences in comparison to intracellular amastigotes. Assays with macrophage-amastigotes models are considered closest to the pathophysiological conditions of leishmaniasis, and are therefore the most appropriate for in vitro screening. Differentiated, non-dividing human acute monocytic leukemia cells (THP1) (make an attractive) alternative to isolated primary macrophages and can be used for assaying anti-leishmanial activity of different compounds against intracellular amastigotes.
Here, we present a parasite-rescue and transformation assay with differentiated THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani for screening pure compounds and natural products extracts and determining the efficacy against the intracellular Leishmania amastigotes. The assay involves the following steps: (1) differentiation of THP1 cells to non-dividing macrophages, (2) infection of macrophages with L. donovani metacyclic promastigotes, (3) treatment of infected cells with test drugs, (4) controlled lysis of infected macrophages, (5) release/rescue of amastigotes and (6) transformation of live amastigotes to promastigotes. The assay was optimized using detergent treatment for controlled lysis of Leishmania-infected THP1 cells to achieve almost complete rescue of viable intracellular amastigotes with minimal effect on their ability to transform to promastigotes. Different macrophage:promastigotes ratios were tested to achieve maximum infection. Quantification of the infection was performed through transformation of live, rescued Leishmania amastigotes to promastigotes and evaluation of their growth by an alamarBlue fluorometric assay in 96-well microplates. This assay is comparable to the currently-used microscopic, transgenic reporter gene and digital-image analysis assays. This assay is robust and measures only the live intracellular amastigotes compared to reporter gene and image analysis assays, which may not differentiate between live and dead amastigotes. Also, the assay has been validated with a current panel of anti-leishmanial drugs and has been successfully applied to large-scale screening of pure compounds and a library of natural products fractions (Tekwani et al. unpublished).

Watch this Scientific Journal Video about A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic L

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A فحص الطفيليات الإنقاذ وتحول الخلايا المصابة مع THP1<em&gt; في المختبر</em&gt; مع<em&gt; الليشمانيا الدونوفانية</em&gt; تم الأمثل لفحص المخدرات المضادة لليشماني. ويشمل الفحص تمايز الخلايا THP1، والعدوى مع promastigotes والعلاج بالأدوية الاختبار، تحلل للرقابة من الضامة المصابة، إنقاذ amastigotes، والتحول إلى promastigotes رصد النمو والانتشار المشيقة مع مقايسة فلوروميتريك.

A الفحص الإنقاذ والتحول لفحص مضاد الليشمانيات الطفيلي داخل الخلايا ضد<em&gt; الليشمانيا الدونوفانية</em&gt; Amastigotes في THP1 الحادة اللوكيميا الإنسان الوحيدات الخط الخليوي

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs

داء الليشمانيات الجلدي في الجلد الظهرية من الهامستر: نموذجا مفيدا لفحص المخدرات مضاد الليشمانيات

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

فحص فينوطيبيك مجهري للقياس الكمي للبكتيريا الفطرية داخل الخلايا المكيفة للفحص عالي الإنتاجية/عالي المحتوى

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

تدفق تحليل Cytometric من القاتل الطبيعي خلية التحللي آخر في الدم الجامع البشري

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

نظام لفعالية والسمسة فحص مثبطات استهداف بين الخلايا<em&gt; المتفطرة السلية</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish

عزل السكان الجانب في الخلايا التائية التي يسببها ميك الخلايا اللمفاوية الحادة اللمفاوية في الزرد

Heterogeneous cell populations, from either healthy or malignant tissues, may contain a population of cells characterized by a differential ability to ...

A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

لفحص يستند إلى الخلية جزيرة البنكرياس مورين للمواد الكيميائية البيئية ديابيتوجينيك

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to ...

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

التحديد الكمي "النمو داخل الخلايا داخل الضامة" هو سريع وطريقة يمكن الاعتماد عليها لتقييم الفوعة طفيليات الليشمانيا

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

بروتوكول نفطة شفط لدراسة الخلية تي البشرية استدعاء الاستجابات في فيفو

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

باستخدام الإنسان المستحثة الخلايا الجذعية مستحث المعوية المشتقة لدراسة وتعديل الحماية الخلوية الظهاريه ضد السالمونيلا ومسببات الامراض الأخرى

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

إنقاذ فيروس زيكا المؤتلف من استنساخ cDNA كروموسوم اصطناعي جرثومي

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...