Name: a parasite rescue and transformation assay for antileishmanial screening against intracellular leishmania donovani amastigotes in thp1 human acute monocytic leukemia cell line
Uploaded: 2012-12-30T12:00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic L

הסכם NCNPR-USDA-ARS המדעי המספר 58-6408-2-0009; פרס CDMRP מענק # W81XWH-09-2-0093 על ידי הצבא האמריקאי למחקר רפואי ואמצעי פיקוד.

1. לשמור ותת תרבות תאים THP1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור THP1 תאים ב- 1640 RPMI בינוני (עם 10% FBS ו-pH 7.4) על 37 מעלות צלזיוס בCO 2 חממה 5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים תת פעמים בשבוע כדי למנוע חריגה מספירת תאי 1x10 6 תאים / מ&quot;ל. זה חשוב כדי לשמור על יכולת השינוי שלהם. </li></ol> 2. לשמור ותת ישמניה donovani Promastigotes תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על L. donovani promastigotes (S1, מתח סודאן) בRPMI-1640 בינוני (ללא סודיום ביקרבונט ופירובט נתרן) עם 10% FBS ב26 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ל &#39;תת תרבות donovani promastigotes פעמים בשבוע, עם ריכוז הגבוה ביותר תאים בטווח של 20-25x10 6 / promastigotes ml.Caution: כל אמצעי התקשורת והפתרונים יש להביא לטמפרטורת החדר לפני השימוש. </li></ol> 3. זריעה והתמיינות של התאים בTHP1 9Microplate 6-היטב ושקופיות תרבות זכוכית 16-קאמריות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן THP1 תרבות מדוללת עם ספירת תאים של 2.5x10 5 תאים / מ&quot;ל מתרבית תאים של ארבעה ימים בן (ספירת תאים לא תעלה על 10 6 תאים / מ&quot;ל) בRPMI-1640 עם FBS 10% חום מומת. הכין 20 מ&quot;ל של תרבות לכל צלחת 96 היטב ו4 מ&quot;ל של תרבות לכל שקופית קאמרית 16-כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף phorbol 12-13-myristate יצטט (PMA) (לבידול של THP1) להשעית תרבית תאים בדילול מלאה (10 מ&quot;ל μl/20 תרבות מהמניות של 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​בDMSO) (PMA ריכוז סופי בתרבות תאים צריך להיות מדוללת 25 ng / ml). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשוות את תמונת הניתוח-ספירת Assay-Digital---הישיר והטפיל-Rescue-טרנספורמציה-Assay, להגדיר את המבחנים בו זמנית בצלחת ברורה, שטוחה תחתונה, 96-16-וגם קאמריים, זכוכית, שקופית התרבות מיקרוסקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 200 μl של תאי THP1-PMA-טופלו לכל באר או קאמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת עמ &#39;96-היטבlates ושקופיות קאמריות 16-גם ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 חממת הלילה כדי לאפשר בידול כמעט מוחלט של התאים. </li></ol> הערה: THP1 התאים, אשר בדרך כלל גדלים בהשעיה, הם מובחנים למקרופאגים חסיד. 4. זיהום של תאי THP1 השתנו עם Promastigotes donovani ישמניה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזיהום של תרבית תאים מובחנות THP1 עם promastigotes donovani ישמניה, רוב הטפילים צריכים להיות בשלב metacyclic תולעת (צורות גליליות ארוכות, ~ יום 5-6 תרבות הישנה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> THP1 תא 1:10 ליחס הטפיל הוא אופטימלי לזיהום הוא ב- Assay הדיגיטלי-ישיר-ספירת Image-ניתוח וPromastigote-Rescue-טרנספורמציה-Assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תרבות מדוללת ל &#39; donovani promastigotes עם ספירה טפילה של טפיל 2.5x10 6 / מ&quot;ל (לTHP1 תאים: יחס טפילים = 1:10) מתרבות 5-6 בגיל יום ב- 1640 RPMI בינוני עם 2% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהשלב 3.5 (לאחר התמיינות הלילה של תרבית תאים THP1) להוציא את הצלחות ושקופיות קאמריות, להסיר את המדיום ולשטוף את תרביות תאי פעם עם 1640 RPMI בינוני סרום ללא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפה קפדנית של PMA-טופל THP1 תאים עם סרום נטול חמים RPMI-1640 (~ 37 ° C) בינוני,, החלף את מדיום סרום ללא עם 200 μl של התרבות המדוללת ל &#39; promastigotes donovani (2.5x10 6 טפילים / מ&quot;ל) מצעד 4.3. הגדר את בארות הבקרה של THP1 תאים ללא טפיל והטפיל בלי THP1 תאים בכל צלחת ושקופיות קאמריות 16-כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הוספת הטפיל לתרבית תאי THP1, דגירת הצלחת ושקופיות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 24 שעות כדי לאפשר את הטפילים להדביק את THP1 תאים המובחנים. </li></ol> 5. טיפול בהמקרופאגים נגועים בסמי בדיקה / תרכובות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבחןAmphotericin B, Pentamidine וMiltefosine כתרופות נוגדות leishmanial סטנדרטיות להקרנה. הכן פתרוני מניות של התרופות / תרכובות בדיקה במים או DMSO כאמורים בטבלה מגיבה. בדוק כל מתחם סמים בגיל 6 ריכוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סדרתי לדלל (1:5) את התרופות הרגילות ותרכובות בדיקה בצלחת טריה 96 היטב או 2 צינורות מ&quot;ל (עבור שקופיות קאמריות) עם 1640 RPMI בינוני עם 2% FBS. התרופות / הריכוז מתחם בדיקה בצלחת זה הן 2X של ריכוזים סופיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטף את כלי התרבות והשקופיות קאמריות נגועים בL. promastigotes donovani (מצעד 4.5) לפחות 5 פעמים עם, בינוני סרום ללא RPMI-1640. הוסף מדיום התרבות μl 100 (RPMI-1640 עם 2% FBS) לכל באר / קאמרי. את הכביסות המרובות נחוצות כדי להבטיח הסרה מלאה של promastigotes שאינו מופנם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני μl 100 מסמי סדרה מדוללים תקניים אנטי leishmanial או תרכובות בדיקה לכל באר או קאמרי. הגדרת infecתאי THP1 טד שולטים ללא תרופות בו זמנית בכל שקופית צלחת / קאמרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הצלחות והשקופיות קאמריות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ל48 שעות. </li></ol> 6. כתמי שקופיות קאמריות, הדמית פלורסנט מיקרוסקופ וניתוח תמונה לכימות זיהום והשפעה של טיפול תרופתי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירת שעה 48, לשטוף השקופית הקאמרית 3 פעמים ב- 1640 RPMI בינוני סרום ללא. לקלף את תאי פלסטיק מהשקופיות ולתקן את התאים על ידי טבילת השקופיות במתנול למשך 30 שניות. השאר את השקופיות ביו ברדס מתחת לזרימת אוויר לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן הירוק פתרון מכתים SYBR (5X) על ידי דילול (1:2,000) המניות (10,000 X) עם מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכתים את השקופיות בתנאים חשוכים עם גרין SYBR המדולל אני כתם פתרון במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר, לשטוף פעם אחת עם מים ולהשאיר את השקופיות תחת זרימת האוויר לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח coverslip כוס מלאה מעל staiשקופית נד בעזרת מדיום גובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללכוד את התמונות הדיגיטליות של THP1 תאים: ללא זיהום (ריק), עם זיהום (שליטה), תאים נגועים טופלו בתרופות שונות סטנדרטיות או תרכובות בדיקה בדילולים שונים (3 איור, 5 ו 6)) באמצעות מיקרוסקופ ניקון אקליפס 90i ניאון ליווי על ידי תוכנת 3.2 אלמנט AR ש&quot;ח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את גרעיני מקרופאג (גדול) וגרעינים הטפילים (קטן עם kinetoplast) באמצעות ImageJ (איור 7), שהיא תכנית בפומבי זמינה, מבוססת ג&#39;אווה עיבוד תמונה שפותחה במכון הלאומי לבריאות <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">(http://rsb. info.nih.gov / ij / download.html).</a> בטא את הנתונים כמספר amastigotes כל 100 הפך THP1 תאים. </li></ol> 7. הטפיל-Rescue-טרנספורמציה-Assay: תמוגה מבוקרת של L. המקרופאגים donovani Amastigotes נגועים<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף microplate 96-היטב מצעד 5.5 3 פעמים עם התרבות בינונית סרום ללא RPMI-1640. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בין חומרי ניקוי שונים שנבדקו בריכוזים שונים, 0.05% טיפול SDS למשך 30 שניות הן אופטימליות עבור תמוגה מבוקרת (תמוגה תא מרבית עם אובדן מינימאלי של הכדאיות הציל &#39;טפילים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדיום סרום ללא מכל באר אחרי השטיפה האחרונה ולהוסיף 20 μl של RPMI-1640 (עם 0.05% SDS) לכל באר. נער את הצלחת למשך 30 שניות ולהוסיף 180 מלאים μl RPMI-1640 (עם 10% FBS) לכל באר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הצלחות ב 26 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות לטרנספורמציה של amastigotes חולץ לpromastigotes. </li></ol> 8. ניתוח הכמות של Promastigote שינה (alamarBlue assay) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירת 48 שעות ב 26 ° C, כל amastigotes החיות חולצה הופכים לpromastigotes (1D איור). הוסף 10 μl של alamarBlue לכל באר בעמ &#39;96-היטבlates. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הצלחות ב 26 ° C למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירת הלילה, לקרוא את הצלחות לפלואורסצנטי הסטנדרטי בFluostar גלקסי fluorimeter (טכנולוגיות מעבדת BMG) בעירור ננומטר 544, פליטת 590nm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את עקומות תגובה במינון (צמיחת אחוזים לעומת ריכוז של מתחם תרופה או בדיקה) עם ExcelFit (תרשימים 7-9) והמחשוב IC 50/90 ערכי IC מהעקומות האלה (טבלה 1). </li></ol> 9. תקינה של תאי THP1 יחס טפילים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחידויות בTHP1 תאים ליחס טפילים כדי לקבוע רגישות של assay. הערה: זיהום נמוך / גבוה מספרי טפילים / עלול לפגוע ברגישות ובהסלקטיביות של ההקרנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחידויות בTHP1 תאים ליחס טפילים על ידי ביצוע הפרוטוקול שתואר לעיל עבור זריעת THP1 תאים וזיהום promastigote ישמניה (סעיף 3 ו 4) מלבד שימוש הבדליחסי erent של THP1 תאים לטפילים כמו 1:1.25, 1:2.5, 01:05 ו1:10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר את הניסוי בשתי שקופיות 16-קאמריים (לניתוח תמונה) וצלחת 96-היטב (עבור assay טפיל הצלה) פורמטים להשוואת הצלת הטפיל ומבחני ניתוח תמונה. </li></ol> 10. סטנדרטיזציה של חומרי ניקוי שונים לתמוגה תא מבוקרת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המטרה העיקרית של ניסוי זה היא לייעל את הפרוטוקול לתמוגה מבוקרת של תאי THP1 להשיג THP1 תמוגה תאים מרביות / שלמה מבלי להשפיע על הכדאיות של טפילי amastigote חולצו באופן משמעותי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את חומרי ניקוי שונים כגון 20 Tween, Tween 80, טריטון X-100, NP-40 וSDS בריכוזים שונים ומשך זמן שונה של טיפול (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> THP1 תאים ליחס טפילים הם 1:10 ותנאים אחרים הם דומים כמו 1-8 סעיפים לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק 0.05% SDS טיפול נוסף לזמן טיפול שונהs כדי לבצע אופטימיזציה נוספת תמוגה התא המבוקרת. </li></ol>

<ol>
	<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Control of the leishmaniasis: report of a meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniasis. Xii, 22-26 (2010).</li><li>Croft, S. L., Seifert, K., Yardley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+scenario+of+drug+development+for+leishmaniasis.">Current scenario of drug development for leishmaniasis.</a> Indian J. Med. Res. 123 (3), 399-410 (2006).</li><li>Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Resistance+in+Leishmaniasis.">Drug Resistance in Leishmaniasis.</a> Clinical Microbiology reviews. 19 (1), 111-126 (2006).</li><li>Mikus, J., Steverding, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+colorimetric+method+to+screen+drug+cytotoxicity+against+Leishmania+using+the+dye+AlamarBlue.">A simple colorimetric method to screen drug cytotoxicity against Leishmania using the dye AlamarBlue.</a> Parasitology International. 48 (3), 265-269 (2000).</li><li>Callahan, H. L., Portal, A. C., Devereaux, R., Grogl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Axenic+Amastigote+System+for+Drug+Screening.">An Axenic Amastigote System for Drug Screening.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 41 (4), 818-822 (1997).</li><li>Seifert, K., Escobar, P., Croft, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+activity+of+anti-leishmanial+drugs+against+Leishmania+donovani+is+host+cell+dependent.">In vitro activity of anti-leishmanial drugs against Leishmania donovani is host cell dependent.</a> J. Antimicrob. Chemother. 65 (3), 508-511 (2010).</li><li>Kolodziej, H., Kiderlen, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antileishmanial+activity+and+immune+modulatory+effects+of+tannins+and+related+compounds+on+Leishmania+parasitized+RAW+264.7+cells.">Antileishmanial activity and immune modulatory effects of tannins and related compounds on Leishmania parasitized RAW 264.7 cells.</a> Phytochemistry. 66 (17), 2056-2071 (2005).</li><li>Maia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectivity+of+five+different+types+of+macrophages+by+Leishmania+infantum.">Infectivity of five different types of macrophages by Leishmania infantum.</a> Acta Tropica. 103 (2), 150-155 (2007).</li><li>Neal, R. A., Croft, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+system+for+determining+the+activity+of+compounds+against+the+intracellular+amastigote+form+of+Leishmania+donovani.">An in vitro system for determining the activity of compounds against the intracellular amastigote form of Leishmania donovani.</a> J. Antimicrob. Chemother. 14, 463-475 (1984).</li><li>Abdullah, S. M., Flath, B., Presber, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+staining+procedures+for+the+flow+cytometric+analysis+of+U-937+cells+infected+with+different+Leishmania-species.">Comparison of different staining procedures for the flow cytometric analysis of U-937 cells infected with different Leishmania-species.</a> J. Microbiol Methods. 37 (2), 123-138 (1999).</li><li>Giorgio, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometric+Detection+of+Leishmania+Parasites+in+Human+Monocyte-Derived+Macrophages:+Application+to+Antileishmanial-Drug+Testing.">Flow Cytometric Detection of Leishmania Parasites in Human Monocyte-Derived Macrophages: Application to Antileishmanial-Drug Testing.</a> Antimicrob Agents Chemother. 44 (11), 3074-3078 (2000).</li><li>Mandal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+of+Leishmania+donovani+clinical+isolates+against+drug+using+a+colorimetric+&#946;+Lactamase+assay.">High throughput screening of Leishmania donovani clinical isolates against drug using a colorimetric &#946; Lactamase assay.</a> Indian J. Exp. Biol. 47 (6), 475-479 (2009).</li><li>Chan, M. M. Y., Bulinski, J. C., Chang, K. P., Fong, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+assay+for+Leishmania+amazonensis+promastigotes+expressing+multimeric+green+fluorescent+protein.">Microplate assay for Leishmania amazonensis promastigotes expressing multimeric green fluorescent protein.</a> Parasitol. Res. 89 (4), 266-271 (2003).</li><li>Buckner, F. S., Wilson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+assay+for+screening+compounds+against+Leishmania+Amastigote+Grown+in+macrophages.">Colorimetric assay for screening compounds against Leishmania Amastigote Grown in macrophages.</a> Am. J. Trop. Med. 72 (5), 600-605 (2005).</li><li>Sereno, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+perspectives+in+Leishmania+cell+based+drug-screening+procedures.">Advances and perspectives in Leishmania cell based drug-screening procedures.</a> Parasitol. Int. 56 (1), 3-7 (2007).</li><li>Gupta, S., Nishi, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visceral+leishmaniasis:+experimental+models+for+drug+discovery.">Visceral leishmaniasis: experimental models for drug discovery.</a> Indian J. Med. Res. 133, 27-39 (2011).</li><li>Roy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Episomal+and+stable+expression+of+the+luciferase+reporter+gene+for+quantifying+Leishmania+spp.+Infections+in+macrophages+and+in+animal+models.">Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. Infections in macrophages and in animal models.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 110 (2), 195-206 (2000).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

ישנן מספר שיטות זמינות לסריקת תרופות אנטי leishmanial מבוססת על מודלי macrophage-amastigote. מבחנים ניתן לעשות עם מקרופאגים שנאספו מחיות מארחות תאים כלומר הצפק exudate (PEC), תאי דם היקפיים (monocyte PBMC) 6 או עצם מקרופאגים מח נגזרות (BMM) או בשורות תאי monocytic כגון עכבר (J774 וRAW264.7 ) 7 ואנושיים (THP1, U937, HL-60) 8 תאי monocytic. המבחנים, המשתמשים בחלוקת תאי מארח, חייבים לוודא שהתופעות המבלבלות של פעילות תרופה בטפיל והן מספר תאי מארח נחשבות. המקרופאגים העיקריים הבדיל שנאספו ממקורות שונים כגון עכברים וחולדות שאינם מפרידים-בטבע, אבל הכנות התאים האלה לא יכולות להיות אוכלוסיות תאים הומוגניים. שורות תאי Monocytic תאים שמקורם-הן הומוגני בטבע והנם מודל טוב יותר להקרנה macrophage-amastigote המבוססת. מתוך שורות תאים monocytic שונות, diffeTHP1 תאי rentiated (קו אנושי חריף monocytic וקמיה של תאים) יכולים להיוצר monolayer הלא חלוקה, ומציעים חלופה אטרקטיבית למקרופאגים מבודדים ראשוניים. הקרנת macrophage-amastigote מבוססת ניתן לעשות זאת בכמה דרכים. הערכה מיקרוסקופית קלסית המבוססת על תא וטפיל ישיר לספור 9 היא עבודה אינטנסיבית. העדר האוטומציה מגביל את התועלת של בדיקה זו. ספירת התאים היא זמן רב ועשויה לתת קביעה מדויקת של 50 ערכי IC מאז קביעת כדאיות טפיל באמצעות הליך הכתמה קשה. צבעי ניאון רבים ונוגדנים חד שבטיים יכולים להיות מועסקים למבחני זרימת cytometric 10, 11, אבל המבחנים האלה הם גם מוגבלים בגלל רגישות והגבלה של פחות מרווח הזמן של תרופה לטיפול ליום אחד בלבד. ישנם מספר מבחני גן הכתב זמין לכימות הצמיחה של amastigotes התאי 12,13,14. אוטומטהקרנת אד עשויה להיות אפשרית באמצעות גנים מדווחים, אבל המבחנים הללו יש גם חסרונות מסוימים. ראשית, רוב המבחנים אלה מחייבים בחירת תרופה לשמירה על ביטוי episomal של הגנים המדווחים, שלא יכול להיות אידיאלי לניסוי הקרנת סמים. הדרך שבה גן הכתב הוא הציג יכול גם להשפיע על התכונות הפיזיולוגיות של הטפיל ולהשפיע על ההקרנה. אם גן הכתב הוא חלק מפלסמיד episomal, התפוקה היחסית של כתב יכולה להיות תלויה במספר העותק של פלסמיד transfected (אשר משתנה מתא לתא) ולא בפעילות של התרופה 14. חלק מטפילי הכתב אשר הפכו טפילים לא צריכים ללחץ ברירה כדי לשמור על גן הכתב, אולם יכול להיות שיש השלכות ביולוגיות או על ידי שיבוש הארכיטקטורה הגנטית או רק על ידי הנוכחות של חלבוני הכתב הזר 15. בחלק ממבחנים מבוססי גן כתב, ישסוגיות של פעילות רגישות ורקע 16. והכי חשובים, רבים ממבחני כתב ביטוי הגנים, במיוחד אחד עם GFP כתב gene15, לא יכולים להבדיל בין amastigotes תאי החיים והמתים. מבחנים מבוססים על גן הכתב לוציפראז יכולים להבחין בין חיים והמתים amastigotes התאי, אבל מצע וחיץ תמוגה תא למבחנים אלה הם יקרים להקרנה בקנה מידה גדולה 17. כדי להתגבר על חסרונות ומגבלות של מבחני מיון קודמים macrophage-amastigote מבוסס אלה, פתחו ואופטימיזציה assay טפיל ההצלה והשינוי הזה. בדיקה זו מבוססת על THP1 תאים, אשר יש הומוגניות טובה והם אינם מפרידים-בטבע, כמו תאי מארח. Assay הטפיל-Rescue-טרנספורמציה-Assay המתואר כאן הוא להשוות את assay המבוסס על ספירת תמונה דיגיטלית-ניתוח ישיר של amastigotes התאי. מיקרוסקופיה פלורסנט ודסק&quot;ש, דיגיטלי ולדמייןניתוחי דואר על ידי ImageJ לספירת הפרש של גרעיני מקרופאג וגרעיני הטפיל שפרו את assay הספירה המיקרוסקופית נוספים. לכידת התמונות תחת מסנני אור ניאון וניגודיות פער התערבות (DIC) מסננים שפרה את איכות התמונה הדיגיטלית לספירה מדויקת יותר של טפילים תוך תאיים. תמונות שניהם ניאון ודסק&quot;ש ניתן התמזגה כדי להשיג את התמונות הדיגיטליות בקווי מתאר ברורים macrophage סלולריים וגרעינים תאיים ניאון. גרעיני מקרופאג וגרעיני הטפיל יכולים להיות מוכרים באופן דיפרנציאלי עם ImageJ. לכן, שניהם---ספירה-Assay תמונה דיגיטלי-ניתוח ישיר וטפיל-Rescue-טרנספורמציה-Assay יש פוטנציאל לאוטומציה ויישום להקרנה בקנה מידה גדולה. השלבים הקריטיים בטפיל-Rescue-טרנספורמציה-Assay הם: (א) כביסות חוזרות ונשנות של THP1 תרביות תאים לאחר חשיפה לpromastigotes ישמניה, כדי להבטיח הסרה מוחלטת כמעט שאינם מתמחהpromastigotes alized ו( ב) תמוגה מבוקרת של התאים הנגועים THP1 עם SDS. שני הצעדים עלולים גם להיות נשלטו עם אוטומציה ולא צריך להתפשר עם תפוקה של assay. השלב השני של כביסות, לאחר חשיפה של ישמניה THP1 התאים הנגועים לבדיקת הסמים / התרכובות מסיר את הטפילים הנותרים אינם מופנמים, אם בכלל. הטפיל-Rescue-טרנספורמציה-Assay מציע יתרונות משמעותיים על פני, גן קיים מיקרוסקופי כתב ומבחני ניתוח תמונה. הבדיקה היא פשוטה, חזקה, ושחזור, יכולה להיות אוטומטית להקרנה בקנה מידה גדולה, ולכן צריך להיות יישום חשוב בהקרנה של ספריות תרכובות גדולות לגילוי סמים אנטי leishmanial חדש. יתר על כן, הבדיקה יכולה להיות מיושמת גם להערכת infectivity של קליני, כמו גם, שבודדה במעבדה של ישמניה במבחנה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Phorbol 12-13-Myristate יצטט (PMA) </td><td> סיגמה אולדריץ ארה&quot;ב </td><td> P1585 </td><td> דרוש להתמיינות של תאי THP1. </td></tr><tr><td> RPMI-1640 בינוניים </td><td> Invitrogen </td><td> 23400021 </td><td></td></tr><tr><td> מערכת שקופיות הקאמרית Lab-TEK (16 קאמריים) </td><td> Thermo Scientific Nunc </td><td> 178599 </td><td></td></tr><tr><td> , שטוחת תחתית, צלחות ברור 96-Well </td><td> BD פלקון </td><td> 353075 </td><td> צלחות לבצע בדיקת צלחת 96-היטב </td></tr><tr><td> Amphotericin B </td><td> סיגמה אולדריץ ארה&quot;ב </td><td> A4888 </td><td> תרופה סטנדרטית נוגדת leishmanial מתמוססת בDMSO (2 מ&quot;ג / מ&quot;ל) </td></tr><tr><td> Pentamidine Isothionate שאLT </td><td> סיגמה אולדריץ ארה&quot;ב </td><td> P 0547 </td><td> תרופה סטנדרטית נוגדת leishmanial מתמוססת בDMSO (2 מ&quot;ג / מ&quot;ל) </td></tr><tr><td> Miltefosine </td><td> EMD Biosciences ארה&quot;ב </td><td> 475841 </td><td> תרופה סטנדרטית נוגדת leishmanial מתמוססת ב- 1640 RPMI בינוני סרום חינם (להכין טרי) (2 מ&quot;ג / מ&quot;ל) </td></tr><tr><td> Stibogluconate נתרן </td><td> EMD Biosciences ארה&quot;ב </td><td> 567565 </td><td> תרופה סטנדרטית נוגדת leishmanial להכין בRPMI-1640 עם 4% FBS. (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) </td></tr><tr><td> סולפט נתרן Dodecyl </td><td> סיגמה אולדריץ ארה&quot;ב </td><td> L 5750 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ פלואורסצנטי </td><td> NIKON </td><td> ECLIPSE 90i </td><td></td></tr><tr><td> פלואורסצנטי Microplate Reader </td><td> BMG </td><td> פולאר סטאר גלקסי </td><td></td></tr><tr><td> הרכבה בינונית </td><td> סיגמה אולדריץ ארה&quot;ב </td><td> M 1289 </td><td></td></tr><tr><td>lamarBlue </td><td> עבד Serotec </td><td> BUF012 B </td><td></td></tr><tr><td> SYBR הירוק </td><td> סיגמה אולדריץ ארה&quot;ב </td><td> S 9430 </td><td></td></tr><tr><td> סודיום ביקרבונט </td><td> הפישר Sci. </td><td> 523500 </td><td></td></tr><tr><td> פירובט נתרן </td><td> סיגמה אולדריץ ארה&quot;ב </td><td> P2256 </td><td></td></tr><tr><td> 2-Mercaptoethanol </td><td> סיגמה אולדריץ ארה&quot;ב </td><td> M6250 </td><td></td></tr><tr><td> סרום שור עוברי </td><td> אטלנטה ביולוגית </td><td> S11050H </td><td></td></tr><tr><td> 20 Tween </td><td> סיגמה אולדריץ ארה&quot;ב </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> סיגמה אולדריץ ארה&quot;ב </td><td> P6474 </td><td></td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> סיגמה אולדריץ ארה&quot;ב </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> NP-40 </td><td> Calbiochem </tד&gt; <td> 492016 </td><td></td></tr></tbody></table>

a parasite rescue and transformation assay for antileishmanial screening against intracellular leishmania donovani amastigotes in thp1 human acute monocytic leukemia cell line

Leishmaniasis הוא אחת המחלות המוזנחות ביותר בעולם, במידה רבה, המשפיע על העניים שבעניים, בעיקר במדינות מתפתחות. מעל 350 מיליון בני אדם נחשבים בסיכון להידבקות leishmaniasis, וכ 2 מיליון מקרים חדשים מתרחשים 1 שנתי. ישמניה donovani הוא הסוכן סיבתי לleishmaniasis הקרבי (VL), הצורה הקטלנית ביותר של המחלה. הבחירה של תרופות זמינות לטיפול בleishmaniasis מוגבלת 2; טיפולים שוטפים לספק יעילות מוגבלת ורבים מהם רעילים במינונים טיפוליים. בנוסף, רוב התרופות לטיפול הקו הראשונות כבר אבד השירות שלהם בשל הגדלת עמידות לתרופות מרובה 3. הצינור הנוכחי של תרופות הנוגדות leishmanial גם כן מתרוקן בחומרה. מאמצים מתמשכים יש צורך להעשיר את צנרת גילוי חדשה נגד leishmanial סמים, ומאמץ זה מסתמך על הזמינות של דגמים מתאימים בהקרנה חוץ גופייה. ילדה = &quot;jove_content&quot;&gt; בpromastigotes המבחנה 4 מבחני amastigotes axenic 5 משמשים בעיקר לסריקת תרופות אנטי leishmanial עם זאת, ייתכן שאינו מתאים בשל הבדלים משמעותיים סלולריים, פיסיולוגיים, ביוכימי ומולקולרי בהשוואה לamastigotes התאי. מבחנים עם מודלי macrophage-amastigotes נחשבים קרוב ביותר לתנאי pathophysiological של leishmaniasis, ולכן הם המתאימים ביותר להקרנה חוץ גופייה. תאים מובחנים, בלתי מתחלק, אדם חריפים monocytic וקמיה (THP1) (להפוך אטרקטיביים) חלופה למקרופאגים העיקריים המבודדים וניתן להשתמש בו לפעילות אנטי assaying leishmanial של תרכובות שונות נגד amastigotes התאי. כאן, אנו מציגים assay טפיל הצלה והמהפך עם THP1 תאים מובחנים נגועים במבחנה עם ישמניה donovani לסינון תרכובות טהורות ולדרבן טבעייםתמציות ucts וקביעת היעילות נגד amastigotes ישמניה התאית. הבדיקה כוללת את השלבים הבאים: (1) בידול של THP1 תאי המקרופאגים לבלתי מתחלק-, (2) דלקת של מקרופאגים עם ל &#39; donovani metacyclic promastigotes, (3) טיפול בתאים נגועים בסמי בדיקה, (4) תמוגה מבוקרת של מקרופאגים נגועים, (5) שחרור / הצלת amastigotes ו( 6) טרנספורמציה של amastigotes החי לpromastigotes. Assay היה מותאם באמצעות טיפול חומר ניקוי לתמוגה מבוקרת של תאים THP1 ישמניה נגועים כדי להשיג הצלה כמעט מוחלטת של amastigotes התאי קיימא עם השפעה מינימאלית על היכולת שלהם להפוך לpromastigotes. מקרופאג השונה: יחסי promastigotes נבדקו להשיג זיהום מרבי. כימות הזיהום בוצעו באמצעות הפיכתה של חיה, הציל ישמניה amastigotes לpromastigotes והערכה של הצמיחה שלהם על ידי עלאםassay fluorometric arBlue בmicroplates 96-כן. בדיקה זו היא להשוות בשימוש כיום גן המיקרוסקופי, המהונדס כתב ומבחני ניתוח דיגיטליים של תמונות. בדיקה זו היא איתנה ומודדת את amastigotes תאי החיות בהשוואה לגן הכתב ומבחני ניתוח תמונה, שלא יכול להבדיל בין חיים והמתים amastigotes בלבד. כמו כן, הבדיקה אומתה עם פנל נוכחי של תרופות הנוגדות leishmanial ויושמה בהצלחה להקרנה בקנה מידה הגדולה של תרכובות טהורות וספרייה של שברי מוצרים טבעיים (Tekwani et al. לא פורסם).

Watch this Scientific Journal Video about A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic L

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

טפיל הצלה והמהפך assay עם THP1 תאים הנגועים<em&gt; במבחנה</em&gt; עם<em&gt; ישמניה donovani</em&gt; כבר מותאם לסריקת תרופות אנטי leishmanial. הבדיקה כרוכה בהתמיינות של תאי THP1, זיהום עם promastigotes, טיפול עם תרופות בדיקה, תמוגה מבוקרת של מקרופאגים הנגועים, חילוץ amastigotes, שינוי ולצמיחת promastigotes promastigote ניטור והתרבות עם assay fluorometric.

Assay הצלה וטרנספורמציה טפילה להקרנת Antileishmanial נגד תאי<em&gt; ישמניה donovani</em&gt; Amastigotes בקו THP1 אדם חריף Monocytic וקמיה של תאים

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs

Leishmaniasis עורית בעור הגב של אוגרים: מודל שימושי להקרנה של תרופות Antileishmanial

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

בדיקה פנוטיפית מיקרוסקופית לכימות של מיקובקטריה תאית המותאמת להקרנה בתפוקה גבוהה/תוכן גבוה

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

ניתוח תזרים Cytometric של תא הטבעי Killer ממס פעילות דם מלא אנוש

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

מערכת לסינון יעילות Cytotoxicity של מעכבי מיקוד תאי<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish

בידוד של האוכלוסייה בצד Myc- המושרה T- תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה דג הזברה

Heterogeneous cell populations, from either healthy or malignant tissues, may contain a population of cells characterized by a differential ability to ...

A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

הקרנה מבוססת תא מאתר הלבלב איון Diabetogenic כימיקלים סביבתיים

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to ...

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

כימות של צמיחה תאיים בתוך המקרופאגים הוא מהיר, שיטה אמינה להערכת של התקפה אלימה של טפילים לישמניה

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

פרוטוקול שלפוחית היניקה לימודים אדם T-cell האחזור תגובות In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

באמצעות תא גזע המושרה האדם Pluriפוטנטי-המעי הנגזר אורגנואידים ללמוד ולשנות את התא אפיתל הגנה מפני סלמונלה ופתוגנים אחרים

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

הצלה של וירוס רקומביננטי Zika מתוך כרומוזום מלאכותי בקטריאלי cDNA שיבוט

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...