Name: formulations for freeze-drying of bacteria and their influence on cell survival
Uploaded: 2013-08-03T14:00:00
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O trabalho foi financiado pela Fundação Sueca para a Pesquisa Ambiental Estratégica (MISTRA) através do programa DOM e Grant 211.684 (BACSIN) da Comunidade programa quadro europeu FP7 Union. Agradecemos J. Engstrand de assistência em filmar análise de raios-X e L. Tang para ajudar com a narrativa conceitual.

1. Cultivo e colheita de P. putida <ol><li> Prepara-se uma cultura iniciadora de Pseudomonas putida, por inoculação de 100 mL de caldo de soja tríptica (TSB) com uma colónia de P. putida células cultivadas em agar suplementado com caldo de soja tríptico (TSA). Manter a cultura a 30 ° C em uma placa de agitação fixada em 130 rpm. </li><li> Após 7 hr transferir uma parte alíquota da cultura iniciadora equivalente a 1/10 do volume final da cultura principal para TSB-meio fresco. Mant...

<ol>
	<li>Wessman, P., Mahlin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+matrix+properties+on+the+survival+of+freeze-dried+bacteria.">Impact of matrix properties on the survival of freeze-dried bacteria.</a> J. Sci. Food Agric. 91 (14), 2518-2528 (2011).</li><li>Ablett, S., Izzard, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Scanning+Calorimetric+Study+of+Frozen+Sucrose+and+Glycerol+Solutions.">Differential Scanning Calorimetric Study of Frozen Sucrose and Glycerol Solutions.</a> Journal of the Chemical Society-Faraday Transactions. 88 (6), 789-794 (1992).</li><li>Knopp, S. A., Chongprasert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+type+TMDSC+curve+of+frozen+sucrose+solutions+and+collapse+during+freeze-drying.">The relationship between type TMDSC curve of frozen sucrose solutions and collapse during freeze-drying.</a> Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 54 (2), 659-672 (1998).</li><li>Crowe, J. H., Leslie, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+Vitrification+Sufficient+to+Preserve+Liposomes+during+Freeze-Drying.">Is Vitrification Sufficient to Preserve Liposomes during Freeze-Drying.</a> Cryobiology. 31 (4), 355-366 (1994).</li><li>Jain, P., Sen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+glass-forming+biopreservatives+on+head+group+rotational+dynamics+in+freeze-dried+phospholipid+bilayers:+A+P-31+NMR+study.">Effect of glass-forming biopreservatives on head group rotational dynamics in freeze-dried phospholipid bilayers: A P-31 NMR study.</a> Journal of Chemical Physics. 131 (2), (2009).</li><li>Stock, J. B., Rauch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periplasmic+Space+in+Salmonella-Typhimurium+and+Escherichia-Coli.">Periplasmic Space in Salmonella-Typhimurium and Escherichia-Coli.</a> Journal of Biological Chemistry. 252 (21), 7850-7861 (1977).</li><li>Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anhydrobiosis.">Anhydrobiosis.</a> Annual Review of Physiology. 54, 579-599 (1992).</li><li>Leslie, S. B., Israeli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+and+Sucrose+Protect+Both+Membranes+and+Proteins+in+Intact+Bacteria+during+Drying.">Trehalose and Sucrose Protect Both Membranes and Proteins in Intact Bacteria during Drying.</a> Applied and Environmental Microbiology. 61 (10), 3592-3597 (1995).</li><li>Nesarikar, V. V., Nassar, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cations+and+anions+on+glass+transition+temperatures+in+excipient+solutions.">Effect of cations and anions on glass transition temperatures in excipient solutions.</a> Pharmaceutical Development and Technology. 12 (3), 259-264 (2007).</li><li>You, Y., Ludescher, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+sodium+chloride+on+molecular+mobility+in+amorphous+sucrose+detected+by+phosphorescence+from+the+triplet+probe+erythrosin+B.">The effect of sodium chloride on molecular mobility in amorphous sucrose detected by phosphorescence from the triplet probe erythrosin B.</a> Carbohydr. Res. 343 (2), 350-363 (2008).</li><li>Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Nguyen, K. H. N., Crowe, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+vitrification+involved+in+depression+of+the+phase+transition+temperature+in+dry+phospholipids.">Is vitrification involved in depression of the phase transition temperature in dry phospholipids.</a> Biochim. Biophys. Acta Biomembr. 1280, 187-196 (1996).</li></ol>

A motivação para este estudo foi investigar algumas propriedades de formulação que podem ser de grande importância para a sobrevivência da célula durante a liofilização. Embora a tolerância secagem intrínseco varia entre as diferentes espécies, tal como ilustrado na Figura 1A, a tendência de quão bem a formulações diferentes suporte a sobrevivência das células é semelhante. É informativo começar com uma comparação de sacarose e Ficoll. Acredita-se que um factor-chave para uma form...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll PM 400</td>
			<td>GE-healthcare</td>
			<td>17-0300-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEC (Natrosol-M Pharm Grade)</td>
			<td>Ashland</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Gift from Ashland</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPMC (Methocel F4M)</td>
			<td>Dow</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Gift from the Department of Pharmacy, Uppsala University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2395</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71376</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105459</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105458</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyostar II</td>
			<td>FTS Kinetics</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyris Diamond DSC</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker AXS SMART CCD 1k Diffractometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>N.A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-beam FEI Strata DB235 FIB/SEM</td>
			<td>FEI</td>
			<td>N.A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kr&uuml;ss Educational Tensiometer</td>
			<td>Kr&uuml;ss</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formulations for freeze-drying of bacteria and their influence on cell survival

Cellular água pode ser removida para inactivar reversivelmente microorganismos para facilitar o armazenamento. Um tal método de remoção é a liofilização, que é considerado um método de desidratação suave. Para facilitar a sobrevivência das células durante a secagem, as células são frequentemente formuladas anteriormente. A formulação forma uma matriz que incorpora as células e protege-los a partir de várias tensões impostas nocivos sobre as células durante a congelação e secagem. Apresenta-se aqui um método geral para avaliar a taxa de sobrevivência das células após a liofilização e demonstramos pela comparação dos resultados obtidos com quatro formulações diferentes: a sacarose, o dissacárido sacarose derivada polímero Ficoll PM400, e os respectivos polissacáridos hidroxietil celulose (HEC ) e hidroxipropil-metil-celulose (HPMC), em duas estirpes de bactérias, P. putida KT2440 e A. A6 chlorophenolicus. Neste trabalho, ilustram como preparar formulações para liofilização e como para investigar o mecaismos de sobrevivência celular após a reidratação, caracterizando a formulação utilizando de calorimetria exploratória diferencial (DSC), medições de tensão superficial, análise de raios-X e microscopia eletrônica e relacionar esses dados com as taxas de sobrevivência. Os polímeros foram escolhidas para obter uma estrutura monomérica do respectivo polissacarídeo sacarose assemelhando-se a um em graus variados. Usando este método de instalação que mostrou que os polímeros podem suportar a sobrevivência celular tão eficazmente como dissacarídeos se certas propriedades físicas da formulação é controlada 1.

A Tabela 1 mostra dados sobre a composição da formulação, eventos gravados térmicas por DSC durante o aquecimento das formulações congeladas, a estrutura das amostras secas e a tensão superficial das soluções de formulação. A T g »de sacarose ter sido determinada a -40 ° C, 2, 3 e pode ser difícil de detectar concentrações de sacarose para abaixo de 20% w / w. A ocorrência térmica a -35 ° C, é, provavelmente, relacionado com o aparecimento de dissoluç...

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Formulations for Freeze-drying of Bacteria and Their Influence on Cell Survival

Liofilização é muitas vezes uma forma fácil e conveniente de obter produtos secos de células bacterianas viáveis. Uma questão do processo é a sobrevivência da célula. Nós detalhe aqui um processo para investigar a forma como a sobrevivência das células durante a liofilização é influenciada pelas propriedades da formulação utilizada.

As formulações para liofilização de bactérias e sua influência na sobrevivência das células

Cellular water can be removed to reversibly inactivate microorganisms to facilitate storage. One such method of removal is freeze-drying, which is ...

Research

JoVE Journal

Biology

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

Obtenção Hemócitos do Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes Observando e sua adesão a bactérias simbióticas e não-simbióticas

Studies concerning the role of the immune system in mediating molecular signaling between beneficial bacteria and their hosts have, in recent years, made ...

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Analisando a função de GTPases Pequenas pela microinjeção de Plasmids em Polarized Células Epiteliais

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