Name: staining protocols for human pancreatic islets
Uploaded: 2012-05-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Staining Protocols for Human Pancreatic Islets at JoVE.com

De auteurs danken de donateurs de familie en de Organ Procurement Organisaties die betrokken zijn bij dit onderzoek en Emily Montgomery, Robert Pietras, Ann Fu, Mitali Agarwal, en Roshan Agarwal voor hun deskundige hulp. Dit werk werd gefinancierd door de Juvenile Diabetes Research Foundation (MC-T.) ter ondersteuning van het netwerk voor Pancreatic Organ Donors met diabetes.

1. Coupes voor het ongekleurde secties <ol><li> Stel waterbad en microtoom als voor standaard paraffine coupes. Gebruik positief geladen dia&#39;s en pre-label met zaaknummer, pancreas regio (monster) en slide nummer. Plaats paraffineblok in de microtoom boorkop met de cassette label aan de linkerkant. </li><li> Volgens de normale procedures coupes, sectie in blok tot weefsel wordt gelijkmatig aangetroffen. Maak een lint van seriële secties (4 micrometer dik, 3-6 afhankelijk van het aantal vereiste initiële vlekken ...

<ol>
	<li>In't Veld, P., Marichal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+anatomy+of+the+human+islet+of+Langerhans.">Microscopic anatomy of the human islet of Langerhans.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 654, 1-19 (2010).</li><li>Matveyenko, A. V., Butler, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+beta-cell+mass+and+diabetes+onset.">Relationship between beta-cell mass and diabetes onset.</a> Diabetes Obes. Metab. 10, 23-31 (2008).</li><li>Saisho, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreas+volumes+in+humans+from+birth+to+age+one+hundred+taking+into+account+sex,+obesity,+and+presence+of+type-2+diabetes.">Pancreas volumes in humans from birth to age one hundred taking into account sex, obesity, and presence of type-2 diabetes.</a> Clin. Anat. 20, 933-942 (2007).</li><li>Hruban, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+intraepithelial+neoplasia:+a+new+nomenclature+and+classification+system+for+pancreatic+duct+lesions.">Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions.</a> Am. J. Surg. Pathol. 25, 579-586 (2001).</li><li>Campbell-Thompson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+adenocarcinoma+patients+with+localised+chronic+severe+pancreatitis+show+an+increased+number+of+single+beta+cells,+without+alterations+in+fractional+insulin+area.">Pancreatic adenocarcinoma patients with localised chronic severe pancreatitis show an increased number of single beta cells, without alterations in fractional insulin area.</a> Diabetologia. 52, 262-270 (2009).</li><li>Meier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-cell+replication+is+the+primary+mechanism+subserving+the+postnatal+expansion+of+beta-cell+mass+in+humans.">Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans.</a> Diabetes. 57, 1584-1594 (2008).</li><li>Rowe, P. A., Campbell-Thompson, M. L., Schatz, D. A., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pancreas+in+human+type+1+diabetes.">The pancreas in human type 1 diabetes.</a> Semin. Immunopathol. 33, 29-43 (2011).</li><li>Veld, I. n. '. t., P, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulitis+in+human+type+1+diabetes:+The+quest+for+an+elusive+lesion.">Insulitis in human type 1 diabetes: The quest for an elusive lesion.</a> Islets. 3, 131-138 (2011).</li><li>van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+diabetes:+etiology,+immunology,+and+therapeutic+strategies.">Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies.</a> Physiol Rev. 91, 79-118 (2011).</li></ol>

Standaardisatie van IHC-procedures is van cruciaal belang voor het imago van de analyse, met name bij het gebruik van computer-gebaseerde algoritmen in een groot aantal dia&#39;s in de tijd. De IHC kleuring procedure zoals beschreven in dit rapport zal batch analyse van de monsters een bepaalde donor met behulp van een Autostainer binnen een 8-urige werkdag en worden aangepast van een eerder verslag 5. Gedigitaliseerde hele dia&#39;s van elk glas dia&#39;s ter beschikking gesteld van nPOD-gelieerde onderzoeke...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> 30% waterstofperoxide (H 2 O 2) </td><td> FisherScientific </td><td> H325-500 </td><td> Endogene peroxidase blokkeren </td></tr><tr><td> ABC-alkalische fosfatase (AP) </td><td> Vector </td><td> AK-5000 </td><td> AP conjugaat </td></tr><tr><td> Antibody Diluent </td><td> Invitrogen </td><td> 003218 </td><td> Primaire antilichamen </td></tr><tr><td> Avidine blocker </td><td> Vector </td><td> SP-2001 </td><td> Blokkeer endogene biotine </td></tr><tr><td> Gebiotinyleerd geit anti-cavia </td><td> Vector </td><td> BA-7000 </td><td> Secundair antilichaam </td></tr><tr><td> Blauwen Reagens </td><td> FisherScientific </td><td> 7301 </td><td> Leica autostainer </td></tr><tr><td> Citraat buffer, pH 6,0 </td><td> BioGenex </td><td> HK086-9K </td><td> Antigen retrieval </td></tr><tr><td> Nabezinker 1 </td><td> FisherScientific </td><td> 7401 </td><td> Leica Autostainer </td></tr><tr><td> Cytoseal XYL </td><td> FisherScientific </td><td> 8312-4 </td><td> Dekglaasje inbedmiddel </td></tr><tr><td> DAB </td><td> Vector </td><td> SK-4100 </td><td> HRP chromogeen </td></tr><tr><td> Deeb </td><td> DAKO </td><td> S2003 </td><td> Endogene AP blokkerend reagens </td></tr><tr><td> Eosine Y Alcoholische </td><td> FisherScientific </td><td> 71204 </td><td> Leica Autostainer </td></tr><tr><td> Ethanolen-100%, 95%, 90%, 70% </td><td> FisherScientific </td><td> Diverse </td><td> Deparaffinization en afdekken </td></tr><tr><td> Hematoxylin </td><td> DAKO </td><td> S3301 </td><td> Dako Autostainer </td></tr><tr><td> Hematoxylin 7211 </td><td> FisherScientific </td><td> 7211 </td><td> Leica Autostainer </td></tr><tr><td> IgG (alle gastheren voor primaire antilichamen) </td><td> Diverse </td><td> Diverse </td><td> Negatieve controles voor primaries </td></tr><tr><td> Liquid Permanente Rood (LPR) </td><td> DAKO </td><td> K0640 </td><td> AP chromogeen </td></tr><tr><td> Mach2 AP </td><td> Biocare Medische </td><td> MALP521L </td><td> Geit anti-muis AP conjugaat </td></tr><tr><td> Mach2 HRP </td><td> Biocare Medische </td><td> MHRP520L </td><td> Geit anti-muis HRP-conjugaat </td></tr><tr><td> Mach2 HRP </td><td> Biocare Medische </td><td> RHRP520L </td><td> Geit anti-muis HRP-conjugaat </td></tr><tr><td> Methanol </td><td> FisherScientific </td><td> Diverse </td><td> H 2 O 2 verdunningsmiddel </td></tr><tr><td> Normaal geit serum </td><td> Vector </td><td> S-1000 </td><td> IHC blokkerend reagens </td></tr><tr><td> Scherpschutter </td><td> Biocare Medische </td><td> BS966M </td><td> IHC blokkerend reagens </td></tr><tr><td> TBST 20X </td><td> ThermoScientific </td><td> TA-999-TT </td><td> IHC buffer </td></tr><tr><td> Triology 20x </td><td> Cell Marque </td><td> 920P-06 </td><td> Antigen Retrieval </td></tr><tr><td> Xyleen </td><td> FisherScientific </td><td> Diverse </td><td> Deparaffinization en afdekken </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Reagentia. <table border="1"><tbody><tr><td> Primaire antilichamen </td><td> Gastheersoort </td><td> Verkoper </td><td> Cat. # </td><td> Commentaar en Antigen Retrieval </td></tr><tr><td> Paraffine </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Amylase </td><td> Muis </td><td> Santa Cruz </td><td> SC-46657 </td><td> Citraat </td></tr><tr><td> Amylin </td><td> Muis </td><td> Serotec </td><td> MCA11267 </td><td> Citraat </td></tr><tr><td> Koolzuuranhydrase 19,9 </td><td> Muis </td><td> Abcam </td><td> ab15146 </td><td></td></tr><tr><td> Caspase-3, gesplitst </td><td> Konijn </td><td> Cell Signaling </td><td> 9961 </td><td> Citraat of Trilogy </td></tr><tr><td> CD20 </td><td> Muis </td><td> DAKO </td><td> M0755 </td><td> Citraat of Trilogy </td></tr><tr><td> CD3 </td><td> Konijn </td><td> DAKO </td><td> A0452 </td><td> Citraat </td></tr><tr><td> CD34 </td><td> Muis </td><td> Cell Signaling </td><td> 3569 </td><td> Citraat </td></tr><tr><td> CD4 </td><td> Muis </td><td> DAKO </td><td> M7310 </td><td> Citraat </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> CD45 </td><td> Muis </td><td> DAKO </td><td> M0754 </td><td> Citraat </td></tr><tr><td> CD68 </td><td> Muis </td><td> DAKO </td><td> M0876 </td><td> Citraat </td></tr><tr><td> CD8 </td><td> Muis </td><td> DAKO </td><td> M7103 </td><td> Citraat </td></tr><tr><td> Chromogranine A </td><td> Konijn </td><td> DAKO </td><td> A0430 </td><td> Citraat </td></tr><tr><td> CK17 </td><td> Muis </td><td> DAKO </td><td> M7046 </td><td> Citraat </td></tr><tr><td> CK19 </td><td> Muis </td><td> DAKO </td><td> M0772 </td><td> Citraat </td></tr><tr><td> CK7 </td><td> Muis </td><td> DAKO </td><td> M7018 </td><td> Citraat </td></tr><tr><td> C-peptide </td><td> Konijn </td><td> Cell Signaling </td><td> 4593 </td><td> Citraat </td></tr><tr><td> Foxp3 </td><td> Rat </td><td> e bio- </td><td> 14-4776-80 </td&gt; <td> Citraat </td></tr><tr><td> Ghreline </td><td> Geit </td><td> Santa Cruz </td><td> SC-10386 </td><td></td></tr><tr><td> Ghreline </td><td> Konijn </td><td> Abcam </td><td> ab85104 </td><td></td></tr><tr><td> Glucagon </td><td> Konijn </td><td> DAKO </td><td> A0565 </td><td></td></tr><tr><td> Glucagon </td><td> Muis </td><td> Abcam </td><td> ab10988 </td><td> Citraat </td></tr><tr><td> Glucagon </td><td> Cavia </td><td> Bachem </td><td> T-5037 </td><td> Citraat </td></tr><tr><td> GLUT-1 </td><td> Muis </td><td> Abcam </td><td> ab40084 </td><td> Trilogie </td></tr><tr><td> Glut-2 </td><td> Konijn </td><td> Santa Cruz </td><td> SC-9117 </td><td> Niet in menselijke eilandjes </td></tr><tr><td> Insuline </td><td> Cavia </td><td> DAKO </td><td> A0564 </td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> Ki-67 </td><td> Muis </td><td> DAKO </td><td> M7240 </td><td> Citraat </td></tr><tr><td> Mafa </td><td> Konijn </td><td> Novus Biologische </td><td> NB400-137A </td><td> Trilogie </td></tr><tr><td> Alvleesklier polypeptide </td><td> Konijn </td><td> Invitrogen </td><td> 18-0043 </td><td> Citraat </td></tr><tr><td> PDX-1 </td><td> Cavia </td><td> Abcam </td><td> ab47308 </td><td> Citraat of Trilogy </td></tr><tr><td> Pro-insuline </td><td> Muis </td><td> Novocastra </td><td> NCL-www.proin-1G4 </td><td></td></tr><tr><td> Pro-insuline </td><td> Muis </td><td> Developmental Studies Hybridoma Bank </td><td> GS-9A8 </td><td> Citraat </td></tr><tr><td> Secretagogin </td><td> Konijn </td><td> Sigma </td><td> HPA 006641 </td><td> Citraat </td></tr><tr><td> Glad spierweefsel actine </td><td> Konijn </td><td> Abcam </td><td> ab5694 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> Somatostatine </td><td> Konijn </td><td> DAKO </td><td> A0566 </td><td></td></tr><tr><td> Synaptofysine </td><td> Muis </td><td> DAKO </td><td> M0776 </td><td> Citraat </td></tr><tr><td> Fresh Frozen </td><td> Gastheersoort </td><td> Verkoper </td><td> Cat. # </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> CD11b </td><td> Rat </td><td> Abcam </td><td> ab6332 </td><td> Bevestig met 4% PF </td></tr><tr><td> CD11c </td><td> Konijn </td><td> Serotec </td><td> AHP1226 </td><td></td></tr><tr><td> CD25 </td><td> Muis </td><td> Novus Biologische </td><td> NB 600-564 </td><td> Gebruik overnacht incuberen paraffine secties </td></tr><tr><td> CD94 </td><td> Muis </td><td> Abcam </td><td> ab61874 </td><td> Bevestig met aceton </td></tr><tr><td> GAD65 </td><td> Muis </td><td> Santa Cruz </td><td> SC-130569 </td><td> Bevestig met 4% PF </td></tr><tr><td> HLA-ABC </td><td> Muis </td><td> DAKO </td><td> M0736 </td><td> Bevestig met aceton of 4% PF </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Primaire antilichamen. <table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Aperio Scanscope CS </td><td> Aperio </td><td></td><td> Digitale diascanner </td></tr><tr><td> DAKO Autostainer Plus </td><td> DAKO </td><td></td><td> IHC vlekken </td></tr><tr><td> Label Matrix software voor het afdrukken </td><td> BioCarta </td><td> LM7UP57 </td><td> Slide label software </td></tr><tr><td> Leica XL Autostainer </td><td>Leica </td><td></td><td> H &amp; E vlekken </td></tr><tr><td> Premium dekglaasje </td><td> FisherScientific </td><td> 12 tot 548-5J </td><td> Dekglaasje </td></tr><tr><td> Spectrum Information Manager </td><td> Aperio </td><td></td><td> Scanner software </td></tr><tr><td> Superfrost Plus schuift </td><td> FisherScientific </td><td> 12-550-15 </td><td> Positief geladen dia&#39;s </td></tr><tr><td> Groentestomer </td><td> Black &amp; Decker </td><td> Diverse </td><td> Antigen retrieval </td></tr><tr><td> Zebra TLP 3742 </td><td> CDWG </td><td> TLP3742 </td><td> Slide labelprinter </td></tr></tbody></table> Tabel 3. Specifieke voorraden en apparatuur.

staining protocols for human pancreatic islets

Schattingen van eilandje gebied en nummers en endocriene cellen samenstelling in de volwassen menselijke pancreas variëren van enkele honderdduizenden tot enkele miljoenen-en beta-massa bereiken 500 tot 1500 mg 1-3. Met deze bekende heterogeniteit, is een standaard verwerking en kleuring procedure ontwikkeld, zodat de pancreas regio&#39;s duidelijk waren omschreven en eilandjes gekarakteriseerd met behulp van strenge histopathologie en immunolocalization examens. Gestandaardiseerde procedures voor de verwerking van de menselijke alvleesklier hersteld van orgaandonoren zijn beschreven in deel 1 van deze serie. De alvleesklier wordt verwerkt in 3 grote regio&#39;s (hoofd, lichaam, staart), gevolgd door dwarsdoorsneden. Dwarsprofielen van de alvleesklier hoofd zijn verder onderverdeeld, zoals aangegeven op basis van grootte, en genummerd op alfabetische volgorde de onderafdelingen aan te duiden. Deze standaardisatie zorgt voor een volledige dwarsdoorsnede-analyse van het hoofd regio, waaronder de uncinate regio die bestaat uit eilandjes bevatvoornamelijk uit de pancreas polypeptide cellen naar de staart regio. Het huidige rapport bevat deel 2 van deze serie en beschrijft de procedures die worden gebruikt voor seriële snijden en histopathologische karakterisering van de pancreas paraffinecoupes met de nadruk op eilandje endocriene cellen, replicatie, en T-cel infiltreert. Pathologie van de pancreas secties is bedoeld om zowel de exocriene, ductular, en endocriene componenten te karakteriseren. De exocrine compartiment wordt onderzocht op de aanwezigheid van pancreatitis (actieve of chronisch) atrofie, fibrose en vetten, alsmede het kanalensysteem, vooral in verband met de aanwezigheid van pancreatische intraductal neoplasie 4. Eilandjes worden beoordeeld op morfologie, de grootte en dichtheid, endocriene cellen, ontsteking, fibrose, amyloid, en de aanwezigheid van replicerende of apoptotische cellen met behulp van H &amp; E en IHC vlekken. Het laatste onderdeel beschreven in deel 2 is de bepaling van de gebrandschilderde afbeeldings in gedigitaliseerde objectglaasje beelden. De gedigitaliseerde dia&#39;s worden georganiseerd door het geval en de alvleesklier regio in een online databank pathologie het creëren van een virtuele biobank. Toegang tot deze online collectie is momenteel aan meer dan 200 clinici en wetenschappers die betrokken zijn bij type 1 diabetes onderzoek. De online database biedt de mogelijkheid voor een snelle en volledige uitwisseling van gegevens en voor de onderzoekers om blokken voor paraffine of ingevroren seriële secties te selecteren.

Watch this Scientific Journal Video about Staining Protocols for Human Pancreatic Islets at JoVE.com

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Deze video demonstreert de procedures voor de karakterisering van humane pancreatische eilandjes met hematoxyline en eosine (H &amp; E) en immunohistochemie (IHC). Pancreas delen van het hoofd, lichaam en staart regio&#39;s worden gekleurd door zowel H &amp; E en IHC te eilandje endocriene samenstelling (insuline, glucagon, en pancreas polypeptide), cel-replicatie (Ki67) en inflammatoire infiltraten (H &amp; E, CD3) te bepalen. De uncinate regio is gelokaliseerd met behulp van IHC voor pancreas polypeptide.

Kleuring Protocols for Human pancreatische eilandjes

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

Isolatie van de Mens Eilandjes van Gedeeltelijk Pancreatectomized Patiënten

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

Immunohistochemical Staining of B7-H1 (PD-L1) on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

Immunohistochemical Staining of B7-H1 PD-L1 on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

Immunohistochemische kleuring van B7-H1 (PD-L1) op paraffine ingebedde Slides van Pancreatic Darmkanker Tissue

B7-H1/PD-L1, a member  of the B7 family of immune-regulatory cell-surface proteins, plays an important  role in the negative regulation of cell-mediated ...

Surgical Procedures for a Rat Model of Partial Orthotopic Liver Transplantation with Hepatic Arterial Reconstruction

Chirurgische ingrepen voor een Rat Model van deelspoelen orthotope levertransplantatie met hepatische arteriële reconstructie

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats using a whole or partial graft is an indispensable experimental model for transplantation research, such as ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Verbeterd protocol voor Laser Microdissection der humane pancreatische eilandjes Van Chirurgische Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Bioluminescent Orthotopic Model of Pancreatic Cancer Progression

Bioluminescent Orthotope Model van pancreaskanker Progression

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%.  New therapeutic options are critically needed and depend on improved ...

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

The use of ex vivo perfused models can mimic the physiological conditions of the liver for short periods, but to maintain normal homeostasis for an ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Isolatie, cultuur en beeldvorming van humane foetale Alvleesklierkanker celclusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

LepR<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Model van Type 2 Diabetes: eilandjes van Langerhans Isolatie en live-cell 2-Photon Imaging van intacte Eilandjes

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Application of End-to-end Anastomosis in Robotic Central Pancreatectomy

Toepassing van End-to-end Anastomosis in Robotic centrale Pancreatectomy

Central pancreatectomy is carried out for the treatment of benign or low-malignant potential tumors located in the pancreatic neck or proximal part of ...

Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model

Intraportal transplantatie van de alvleesklier eilandjes in Mouse Model

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation ...