Name: staining protocols for human pancreatic islets
Uploaded: 2012-05-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Staining Protocols for Human Pancreatic Islets at JoVE.com

Författarna tackar givarna familjer och orgeln organisationer för tillvaratagande inblandade i denna forskning och Emily Montgomery, Robert Pietras, Ann Fu, Mitali Agarwal och Roshan Agarwal för deras experthjälp. Detta arbete har finansierats av Juvenile Diabetes Research Foundation (MC-T.) till stöd för nätverket för givare bukspottkörtel Organ med diabetes.

1. Mikrotomi för Ofärgade avsnitten <ol><li> Ställ in vattenbad och mikrotom som för standard paraffin mikrotomi. Använd positivt laddade bilder och pre-etikett med målnummer, pankreas-regionen (prov) och bildnummer. Plats paraffin-block i mikrotomen chucken med kassetten etiketten på den vänstra sidan. </li><li> Följ normala mikrotomi förfaranden, avsnitt in i blocket tills vävnaden är jämnt påträffas. Skapa ett band av seriella sektioner (4 m tjocka, 3-6 beroende på antalet ursprungliga nödvändiga ...

<ol>
	<li>In't Veld, P., Marichal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+anatomy+of+the+human+islet+of+Langerhans.">Microscopic anatomy of the human islet of Langerhans.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 654, 1-19 (2010).</li><li>Matveyenko, A. V., Butler, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+beta-cell+mass+and+diabetes+onset.">Relationship between beta-cell mass and diabetes onset.</a> Diabetes Obes. Metab. 10, 23-31 (2008).</li><li>Saisho, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreas+volumes+in+humans+from+birth+to+age+one+hundred+taking+into+account+sex,+obesity,+and+presence+of+type-2+diabetes.">Pancreas volumes in humans from birth to age one hundred taking into account sex, obesity, and presence of type-2 diabetes.</a> Clin. Anat. 20, 933-942 (2007).</li><li>Hruban, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+intraepithelial+neoplasia:+a+new+nomenclature+and+classification+system+for+pancreatic+duct+lesions.">Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions.</a> Am. J. Surg. Pathol. 25, 579-586 (2001).</li><li>Campbell-Thompson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+adenocarcinoma+patients+with+localised+chronic+severe+pancreatitis+show+an+increased+number+of+single+beta+cells,+without+alterations+in+fractional+insulin+area.">Pancreatic adenocarcinoma patients with localised chronic severe pancreatitis show an increased number of single beta cells, without alterations in fractional insulin area.</a> Diabetologia. 52, 262-270 (2009).</li><li>Meier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-cell+replication+is+the+primary+mechanism+subserving+the+postnatal+expansion+of+beta-cell+mass+in+humans.">Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans.</a> Diabetes. 57, 1584-1594 (2008).</li><li>Rowe, P. A., Campbell-Thompson, M. L., Schatz, D. A., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pancreas+in+human+type+1+diabetes.">The pancreas in human type 1 diabetes.</a> Semin. Immunopathol. 33, 29-43 (2011).</li><li>Veld, I. n. '. t., P, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulitis+in+human+type+1+diabetes:+The+quest+for+an+elusive+lesion.">Insulitis in human type 1 diabetes: The quest for an elusive lesion.</a> Islets. 3, 131-138 (2011).</li><li>van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+diabetes:+etiology,+immunology,+and+therapeutic+strategies.">Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies.</a> Physiol Rev. 91, 79-118 (2011).</li></ol>

Standardisering av IHC förfaranden är kritisk för bildanalys, speciellt vid användning av dator-baserade algoritmer i stora mängder glider över tiden. IHC färgning som beskrivs i denna rapport kan parti analys av en viss givares prover med en Autostainer inom en 8-timmars arbetsdag och ändras från en tidigare rapport 5. Digitaliserade hela glaset bilder av varje färgade bild görs tillgänglig för nPOD-anslutna utredare genom det webbaserade online-patologi system. Utredarna kan granska givare demo...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet på reagens </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> 30% väteperoxid (H 2 O 2) </td><td> FisherScientific </td><td> H325-500 </td><td> Endogent peroxidas blockerande </td></tr><tr><td> ABC-alkaliskt fosfatas (AP) </td><td> Vektor </td><td> AK-5000 </td><td> AP-konjugatet </td></tr><tr><td> Antikropp Utspädningsmedel </td><td> Invitrogen </td><td> 003.218 </td><td> Primär antikropp </td></tr><tr><td> Avidin blockerare </td><td> Vektor </td><td> SP-2001 </td><td> Blockera endogen biotin </td></tr><tr><td> Biotinylerat get-anti-marsvins- </td><td> Vektor </td><td> BA-7000 </td><td> Sekundär antikropp </td></tr><tr><td> Blåelse Reagens </td><td> FisherScientific </td><td> 7301 </td><td> Leica autostainer </td></tr><tr><td> Citratbuffert, pH 6,0 </td><td> BioGenex </td><td> HK086-9K </td><td> Antigenåtervinning </td></tr><tr><td> Klarningsanordningen 1 </td><td> FisherScientific </td><td> 7401 </td><td> Leica Autostainer </td></tr><tr><td> Cytoseal XYL </td><td> FisherScientific </td><td> 8312-4 </td><td> Täckglas monteringsvätska </td></tr><tr><td> DAB </td><td> Vektor </td><td> SK-4100 </td><td> HRP kromogen </td></tr><tr><td> Deeb </td><td> DAKO </td><td> S2003 </td><td> Endogent AP blockeringsreagens </td></tr><tr><td> Eosin Y Alkoholhaltig </td><td> FisherScientific </td><td> 71.204 </td><td> Leica Autostainer </td></tr><tr><td> Etanoler-100%, 95%, 90%, 70% </td><td> FisherScientific </td><td> Olika </td><td> Deparaffinization och täckglas </td></tr><tr><td> Hematoxylin </td><td> DAKO </td><td> S3301 </td><td> Dako Autostainer </td></tr><tr><td> Hematoxylin 7211 </td><td> FisherScientific </td><td> 7211 </td><td> Leica Autostainer </td></tr><tr><td> IgG (alla värdarter för primära antikroppar) </td><td> Olika </td><td> Olika </td><td> Negativa kontroller för primärfärger </td></tr><tr><td> Liquid Permanent Red (LPR) </td><td> DAKO </td><td> K0640 </td><td> AP kromogen </td></tr><tr><td> Mach2 AP </td><td> Biocare Medical </td><td> MALP521L </td><td> Get-anti-mus AP-konjugatet </td></tr><tr><td> Mach2 HRP </td><td> Biocare Medical </td><td> MHRP520L </td><td> Get-anti-mus-HRP-konjugat </td></tr><tr><td> Mach2 HRP </td><td> Biocare Medical </td><td> RHRP520L </td><td> Get-anti-mus-HRP-konjugat </td></tr><tr><td> Metanol </td><td> FisherScientific </td><td> Olika </td><td> H 2 O 2 utspädningsmedel </td></tr><tr><td> Normalt getserum </td><td> Vektor </td><td> S-1000 </td><td> IHC blockeringsreagens </td></tr><tr><td> Sniper </td><td> Biocare Medical </td><td> BS966M </td><td> IHC blockeringsreagens </td></tr><tr><td> TBST 20X </td><td> ThermoScientific </td><td> TA-999-TT </td><td> IHC buffert </td></tr><tr><td> Trilogi 20x </td><td> Cell Marque </td><td> 920P-06 </td><td> Antigenåtervinning </td></tr><tr><td> Xylen </td><td> FisherScientific </td><td> Olika </td><td> Deparaffinization och täckglas </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Specifika reagens. <table border="1"><tbody><tr><td> Primär antikropp </td><td> Värdarter </td><td> Leverantör </td><td> Kat. # </td><td> Kommentarer och antigenåtervinning </td></tr><tr><td> Fotogen </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Amylas </td><td> Mus </td><td> Santa Cruz </td><td> SC-46.657 </td><td> Citrat </td></tr><tr><td> Amylin </td><td> Mus </td><td> Serotec </td><td> MCA11267 </td><td> Citrat </td></tr><tr><td> Karbanhydras 19,9 </td><td> Mus </td><td> Abcam </td><td> ab15146 </td><td></td></tr><tr><td> Kaspas-3, klövs </td><td> Kanin </td><td> Cellsignalering </td><td> 9961 </td><td> Citrat eller Trilogy </td></tr><tr><td> CD20 </td><td> Mus </td><td> DAKO </td><td> M0755 </td><td> Citrat eller Trilogy </td></tr><tr><td> CD3 </td><td> Kanin </td><td> DAKO </td><td> A0452 </td><td> Citrat </td></tr><tr><td> CD34 </td><td> Mus </td><td> Cellsignalering </td><td> 3569 </td><td> Citrat </td></tr><tr><td> CD4 </td><td> Mus </td><td> DAKO </td><td> M7310 </td><td> Citrat </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> CD45 </td><td> Mus </td><td> DAKO </td><td> M0754 </td><td> Citrat </td></tr><tr><td> CD68 </td><td> Mus </td><td> DAKO </td><td> M0876 </td><td> Citrat </td></tr><tr><td> CD8 </td><td> Mus </td><td> DAKO </td><td> M7103 </td><td> Citrat </td></tr><tr><td> Kromogranin A </td><td> Kanin </td><td> DAKO </td><td> A0430 </td><td> Citrat </td></tr><tr><td> CK17 </td><td> Mus </td><td> DAKO </td><td> M7046 </td><td> Citrat </td></tr><tr><td> CK19 </td><td> Mus </td><td> DAKO </td><td> M0772 </td><td> Citrat </td></tr><tr><td> CK7 </td><td> Mus </td><td> DAKO </td><td> M7018 </td><td> Citrat </td></tr><tr><td> C-peptid </td><td> Kanin </td><td> Cellsignalering </td><td> 4593 </td><td> Citrat </td></tr><tr><td> FOXP3 </td><td> Råtta </td><td> e Bioscience </td><td> 14-4776-80 </td&gt; <td> Citrat </td></tr><tr><td> Ghrelin </td><td> Get </td><td> Santa Cruz </td><td> SC-10.386 </td><td></td></tr><tr><td> Ghrelin </td><td> Kanin </td><td> Abcam </td><td> ab85104 </td><td></td></tr><tr><td> Glukagon </td><td> Kanin </td><td> DAKO </td><td> A0565 </td><td></td></tr><tr><td> Glukagon </td><td> Mus </td><td> Abcam </td><td> ab10988 </td><td> Citrat </td></tr><tr><td> Glukagon </td><td> Marsvin </td><td> Bachem </td><td> T-5037 </td><td> Citrat </td></tr><tr><td> GLUT-1 </td><td> Mus </td><td> Abcam </td><td> ab40084 </td><td> Trilogy </td></tr><tr><td> GLUT-2 </td><td> Kanin </td><td> Santa Cruz </td><td> SC-9117 </td><td> Inte uttrycks i humana öar </td></tr><tr><td> Insulin </td><td> Marsvin </td><td> DAKO </td><td> A0564 </td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> Ki-67 </td><td> Mus </td><td> DAKO </td><td> M7240 </td><td> Citrat </td></tr><tr><td> MAFA </td><td> Kanin </td><td> Novus Biologisk </td><td> NB400-137A </td><td> Trilogy </td></tr><tr><td> Pankreatisk polypeptid </td><td> Kanin </td><td> Invitrogen </td><td> 18-0043 </td><td> Citrat </td></tr><tr><td> PDX-1 </td><td> Marsvin </td><td> Abcam </td><td> ab47308 </td><td> Citrat eller Trilogy </td></tr><tr><td> Proinsulin </td><td> Mus </td><td> Novocastra </td><td> GLA-proin-1G4 </td><td></td></tr><tr><td> Proinsulin </td><td> Mus </td><td> Developmental Studies Hybridoma Bank </td><td> GS-9A8 </td><td> Citrat </td></tr><tr><td> Secretagogin </td><td> Kanin </td><td> Sigma </td><td> HPA 006.641 </td><td> Citrat </td></tr><tr><td> Glattmuskelaktin </td><td> Kanin </td><td> Abcam </td><td> ab5694 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> Somatostatin </td><td> Kanin </td><td> DAKO </td><td> A0566 </td><td></td></tr><tr><td> Synaptophysin </td><td> Mus </td><td> DAKO </td><td> M0776 </td><td> Citrat </td></tr><tr><td> Färskfrusen </td><td> Värdarter </td><td> Leverantör </td><td> Kat. # </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> CD11b </td><td> Råtta </td><td> Abcam </td><td> ab6332 </td><td> Fäst med 4% PF </td></tr><tr><td> CD11c </td><td> Kanin </td><td> Serotec </td><td> AHP1226 </td><td></td></tr><tr><td> CD25 </td><td> Mus </td><td> Novus Biologisk </td><td> Anm 600-564 </td><td> Använd natten inkubation paraffinsektioner </td></tr><tr><td> CD94 </td><td> Mus </td><td> Abcam </td><td> ab61874 </td><td> Fäst med aceton </td></tr><tr><td> GAD65 </td><td> Mus </td><td> Santa Cruz </td><td> SC-130.569 </td><td> Fäst med 4% PF </td></tr><tr><td> HLA-ABC </td><td> Mus </td><td> DAKO </td><td> M0736 </td><td> Fäst med aceton eller 4% PF </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Primära antikroppar. <table border="1"><tbody><tr><td> Namnet på reagens </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Aperio Scanscope CS </td><td> Aperio </td><td></td><td> Digital diascanner </td></tr><tr><td> DAKO Autostainer Plus </td><td> DAKO </td><td></td><td> IHC fläckar </td></tr><tr><td> Label Matrix skrivarprogrammet </td><td> BioCarta </td><td> LM7UP57 </td><td> Slide Label Software </td></tr><tr><td> Leica XL Autostainer </td><td>Leica </td><td></td><td> H &amp; E fläckar </td></tr><tr><td> Premium täckglas </td><td> FisherScientific </td><td> 12-548-5J </td><td> Täckglas </td></tr><tr><td> Spectrum Information Manager </td><td> Aperio </td><td></td><td> Skannerprogrammet </td></tr><tr><td> SuperFrost Plus glider </td><td> FisherScientific </td><td> 12-550-15 </td><td> Positivt laddade bilder </td></tr><tr><td> Vegetabilisk ångare </td><td> Black and Decker </td><td> Olika </td><td> Antigenåtervinning </td></tr><tr><td> Zebra TLP 3742 </td><td> CDWG </td><td> TLP3742 </td><td> Slide etikettskrivare </td></tr></tbody></table> Tabell 3. Särskilda förnödenheter och utrustning.

staining protocols for human pancreatic islets

Uppskattningar av ö-område och antalet och endokrina celler komposition i vuxen human pankreas variera från flera hundra tusen till flera miljoner och beta massa ligger i intervallet från 500 till 1500 mg 1-3. Med denna kända heterogenitet, var en vanlig behandling och färgningsproceduren utvecklas så att bukspottkörteln regioner var tydligt definierade och holmar kännetecknas med rigorös histopatologi och undersökningar immunolokalisering. Standardiserade förfaranden för bearbetning av mänskliga bukspottkörteln återhämtat sig från organdonatorer beskrivs i del 1 av denna serie. Bukspottkörteln är bearbetas i 3 huvudsakliga områden (huvud, kropp, svans) följt av tvärgående sektioner. Tvärgående snitt från bukspottkörteln huvudet är vidare uppdelade, som anges baserat på storlek, och numrerade alfabetiskt att beteckna underavdelningar. Denna standardisering möjliggör en fullständig tvärsektion analys av huvudet regionen inklusive uncinate region som innehåller sammansatta cellöarprimärt av pankreatisk polypeptid celler till svansregionen. Den här rapporten utgör en del 2 i denna serie och beskriver de förfaranden som används för seriell sektionering och histopatologiska karakterisering av avsnitten pankreas paraffin med en betoning på ö endokrina celler, replikering och T-cellinfiltrat. Patologi pankreas sektioner är avsedd att karakterisera både exokrin, duktulära, och komponenter endokrina. Den exokrina facket utvärderas med avseende på närvaro av pankreatit (aktiv eller kronisk), atrofi, fibros, och fett, liksom kanalsystemet, i synnerhet i relation till närvaron av pankreatisk intraduktal neoplasi 4. Cellöarna utvärderades med avseende på morfologi, storlek och densitet, celler endokrina, inflammation, fibros, amyloid, och närvaron av replikerande eller apoptotiska celler med användning av H &amp; E och IHC fläckar. Den sista komponenten beskrivs i del 2 är tillhandahållandet av färgade bildens som digitaliserade hela glaset bilder. De digitaliserade bilderna är organiserade från fall till fall och bukspottkörtel region i en online-databas patologi skapa en virtuell biobank. Tillgång till detta online kollektion tillhandahålls för närvarande till över 200 kliniker och forskare som deltar i typ 1-diabetes forskning. Online databasen ger ett medel för snabb och fullständig datadelning och utredarna att välja block för paraffin eller frysta seriella sektioner.

Watch this Scientific Journal Video about Staining Protocols for Human Pancreatic Islets at JoVE.com

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Denna video demonstrerar förfaranden för karakterisering av humana pankreasöar med hematoxylin och eosin (H &amp; E) och immunohistokemi (IHC). Pankreatiska sektioner från huvud, kropp och regioner svans färgas av både H &amp; E och IHC för att bestämma ö endokrin sammansättning (insulin, glukagon och pankreaspolypeptid), cellreplikation (Ki67) och inflammatoriska infiltrat (H &amp; E, CD3). Den uncinate regionen är lokaliserad användning IHC för pankreatisk polypeptid.

Färgning Protokoll för mänskliga pankreatiska öar

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

Isolering av mänskliga Islets från Delvis Pancreatectomized Patienter

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

Immunohistochemical Staining of B7-H1 (PD-L1) on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

Immunohistochemical Staining of B7-H1 PD-L1 on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

Immunhistokemisk färgning av B7-H1 (PD-L1) på Paraffininbäddade Bilder av Pancreatic Adenocarcinom Tissue

B7-H1/PD-L1, a member  of the B7 family of immune-regulatory cell-surface proteins, plays an important  role in the negative regulation of cell-mediated ...

Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets

Bedöma replikering och betacellsfunktionen i adenoviralt-omvandlade Isolerad gnagare Islets

Glucose homeostasis is primarily controlled by the endocrine hormones insulin and glucagon, secreted from the pancreatic beta and alpha cells, ...

Surgical Procedures for a Rat Model of Partial Orthotopic Liver Transplantation with Hepatic Arterial Reconstruction

Kirurgiska ingrepp för en råttmodell av partiella ortotop levertransplantation med nedsatt arteriell rekonstruktion

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats using a whole or partial graft is an indispensable experimental model for transplantation research, such as ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Förbättrad protokoll för laser mikrodissektion av humana pankreasöar från kirurgiska prover

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Bioluminescent Orthotopic Model of Pancreatic Cancer Progression

Bioluminescent Orthotopic Modell av bukspottkörtelcancer Progression

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%.  New therapeutic options are critically needed and depend on improved ...

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

The use of ex vivo perfused models can mimic the physiological conditions of the liver for short periods, but to maintain normal homeostasis for an ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Isolering, kultur, och avbildning av Human Fetal Pankreas cell kluster

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Musmodell av typ 2-diabetes: Pancreatic Islet Isolering och Live-cell 2-Photon Imaging av intakt cellöar

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Application of End-to-end Anastomosis in Robotic Central Pancreatectomy

Tillämpningen av End-to-end anastomos i Robotic centrala Pancreatectomy

Central pancreatectomy is carried out for the treatment of benign or low-malignant potential tumors located in the pancreatic neck or proximal part of ...