Name: preparation of acute subventricular zone slices for calcium imaging
Uploaded: 2012-09-19T11:00:00
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Este trabalho foi suportado por concessões do NIH (DC007681, AB), Caule CT celular concessão (AB), fundação Pardee (AB), predoctoral Ruth L. Kirschstein Nacional de Pesquisa Serviço de Prêmios (NRSA) (SZY), e um NSF Graduate Research Fellowship (BL). Agradecemos aos membros do laboratório Bordey pelos comentários úteis sobre o manuscrito. O presente material é baseado em trabalho, em parte suportado pelo Estado de Connecticut sob o Stem Cell Research Connecticut Programa de Subsídios. Seu conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representam necessariamente a posição oficial do Estado de Connecticut, o Departamento de Saúde Pública do Estado de Connecticut ou CT Innovations, Incorporated.

1. Preparação de Soluções, dissecação, e Vibratome <ol><li> As soluções devem ser preparadas no osmolaridade correta e pH (Tabela 1). Comparado com fluido cerebrospinal artificial (ACSF), solução de dissecção é preparado com menores concentrações de sódio e de cálcio, e as concentrações mais elevadas de magnésio. Isto é para minimizar os efeitos de excitotoxicidade, durante o corte. </li><li> Ambas as soluções de dissecção e ACSF deve estar saturado com 95% O2 / 5% ...

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	<li>Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chain+formation+and+glial+tube+assembly+in+the+shift+from+neonatal+to+adult+subventricular+zone+of+the+rodent+forebrain.">Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain.</a> J. Comp Neurol. 487, 407-427 (2005).</li><li>Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+recording+subventricular+zone+progenitor+cells+in+live+tissue+of+postnatal+mice.">Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice.</a> Front. Neurosci. 4, 10-3389 (2010).</li><li>Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junction-mediated+calcium+waves+define+communication+networks+among+murine+postnatal+neural+progenitor+cells.">Gap junction-mediated calcium waves define communication networks among murine postnatal neural progenitor cells.</a> Eur. J. Neurosci. , (2011).</li><li>Platel, J. C., Dave, K. A., Gordon, V., Lacar, B., Rubio, M. E., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptors+activated+by+subventricular+zone+astrocytic+glutamate+are+critical+for+neuroblast+survival+prior+to+entering+a+synaptic+network.">NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network.</a> Neuron. 65, 859-872 (2010).</li><li>Platel, J. C., Dupuis, A., Boisseau, S., Villaz, M., Albrieux, M., Brocard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchrony+of+spontaneous+calcium+activity+in+mouse+neocortex+before+synaptogenesis.">Synchrony of spontaneous calcium activity in mouse neocortex before synaptogenesis.</a> Eur. J. Neurosci. 25, 920-928 (2007).</li><li>Young, S. Z., Platel, J. C., Nielsen, J. V., Jensen, N. A., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+increases+calcium+in+subventricular+zone+astrocyte-like+cells+through+L-+and+T-type+voltage-gated+calcium+channels.">GABAA increases calcium in subventricular zone astrocyte-like cells through L- and T-type voltage-gated calcium channels.</a> Front. Cell. Neurosci. 4, 8 (2010).</li><li>Bolteus, A. J., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+Release+and+Uptake+Regulate+Neuronal+Precursor+Migration+in+the+Postnatal+Subventricular+Zone.">GABA Release and Uptake Regulate Neuronal Precursor Migration in the Postnatal Subventricular Zone.</a> J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).</li><li>Platel, J., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tonic+activation+of+GLUK5+kainate+receptors+decreases+neuroblast+migration+in+a+whole+mount+preparation+of+the+subventricular+zone.">Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in a whole mount preparation of the subventricular zone.</a> J. Physiol. (Lond). 586, 3783-3793 (2008).</li><li>Nam, S. C., Kim, Y., Dryanovski, D., Walker, A., Goings, G., Woolfrey, K., Kang, S. S., Chu, C., Chenn, A., Erdelyi, F., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+features+of+postnatal+subventricular+zone+cell+motility:+a+two-photon+time-lapse+study.">Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study.</a> J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).</li><li>Lacar, B. L., Platel, J. C., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+controls+Ca2++activity-dependent+network+synchrony+in+the+adult+neurogenic+forebrain.">GABA controls Ca2+ activity-dependent network synchrony in the adult neurogenic forebrain.</a> , (2007).</li><li>Liu, X., Bolteus, A. J., Balkin, D. M., Henschel, O., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFAP-expressing+cells+in+the+postnatal+subventricular+zone+display+a+unique+glial+phenotype+intermediate+between+radial+glia+and+astrocytes.">GFAP-expressing cells in the postnatal subventricular zone display a unique glial phenotype intermediate between radial glia and astrocytes.</a> Glia. 54, 394-410 (2006).</li><li>Wang, D. D., Krueger, D. D., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+properties+and+ionic+signature+of+neuronal+progenitors+of+the+postnatal+subventricular+zone+in+situ.">Biophysical properties and ionic signature of neuronal progenitors of the postnatal subventricular zone in situ.</a> J. Neurophysiol. 90, 2291-2302 (2003).</li><li>Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., Bargmann, C. I., Jayaraman, V., Svoboda, K., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Zhao, Y., Araki, S., Wu, J., Teramoto, T., Chang, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expanded+palette+of+genetically+encoded+Ca(2)+indicators.">An expanded palette of genetically encoded Ca(2) indicators.</a> Science. 333, 1888-1891 (2011).</li><li>Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+targeted+optical+sensor+to+monitor+calcium+signals+in+astrocyte+processes.">A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes.</a> Nat. Neurosci. 13, 759-766 (2010).</li></ol>

Imagiologia de cálcio de células SVZ tem sido utilizada para estudar os padrões de actividade espontânea em 10 neuroblastos, expressão de receptores de canal em ambos os neuroblastos e astrócitos 4,6,8 e ondas de cálcio astrocíticos 3. Uma vez que as células no SVZ ou são imaturos ou têm propriedades gliais, eles não são acionados acção potenciais 11,12, o que significa que alterações no potencial de voltagem milissegundo indicativos de actividade em redes mad...

<table border="1"><tbody><tr><td> Soluto </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Dissecção (mM) </td></tr><tr><td> Sacarose </td><td> Sigma </td><td> S0389 </td><td> Dissection: 147 mM ACSF: 0 mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S9888 </td><td> Dissecção: 42 mm ACSF: 126 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P3911 </td><td> Dissection: 2,5 mM ACSF: 2,5 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 .6 H 2 O </td><td> Sigma </td><td> M9272 </td><td> Dissecção: 4,33 mM ACSF: 1 mM </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4. H 2 O </td><td> Sigma </td><td> S8282 </td><td> Dissection: 1,25 mM ACSF: 1,25 mM </td></tr><tr><td> Glicose </td><td> Sigma </td><td> G8270 </td><td> Dissection: 10 mM ACSF: 10 mM </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> Sigma </td><td> S6014 </td><td> Dissection: 26 mM ACSF: 26 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 .2 H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C3306 </td><td> Dissection: 1,33 mM ACSF: 2 mM </td></tr></tbody></table> Tabela da lista de Química 1. Receitas e de solução de dissecção e ACSF. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> [Header] </td></tr><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Leica </td><td> VT 1000S </td><td></td></tr><tr><td> Super Glue </td><td> Surehold ou 3M </td><td> Surehold 3G Super Cola ou 3M Vet-Bond </td><td></td></tr><tr><td> Instrumentos de dissecação </td><td> Roboz ou Ted Pella </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fluo-04:00 cálcio-corante sensível </td><td> Invitrogen </td><td> F14201 </td><td></td></tr><tr><td> Verde Oregon-BAPTA 01:00 cálcio-corante sensível </td><td> Invitrogen </td><td> O6807 </td><td></td></tr><tr><td> Solução de Pluronic F-127 a 20% em DMSO </td><td> Invitrogen </td><td> P3000MP </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio confocal vertical </td><td> Olimpo </td><td> FV300 ou FV1000 </td><td></td></tr><tr><td> Imersão em água objetivos </td><td> Olimpo </td><td> LUMPlanFl 40 x W / IR (NA 0,80); LUMPlanFl 60 x W / I (NA 0,90) </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipuladores </td><td> Sutter </td><td> MPC-200/MPC-325/MPC-385 </td><td></td></tr><tr><td> &lt;Controlador de pressão/ Td&gt; <td> Parker Hannifin </td><td> Picospritzer </td><td> &lt;3 PSI durante a aplicação </td></tr><tr><td> Pipeta extrator </td><td> Sutter ou Narshige </td><td> Sutter P-97 ou Narshige PP-830 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetas de vidro </td><td> Sutter </td><td> BF150-110-10 </td><td> ID: 1,10, OD: 1,50 </td></tr><tr><td> Bomba peristáltica </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Modelo 720 </td><td> taxa de fluxo: 1 ml / min </td></tr><tr><td> Banho de Câmara </td><td> Warner Instruments </td><td> RC-26 GLP </td><td> De baixo perfil permite folga objetivo </td></tr><tr><td> Tubulação </td><td> Tygon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Controlador de temperatura </td><td> Warner Instruments </td><td> TC-324B/344B </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 2. Materiais / lista de equipamentos.

preparation of acute subventricular zone slices for calcium imaging

A zona subventricular (SVZ) é uma das duas zonas de origem neural no cérebro pós-natal. A SVZ contém células densamente, incluindo as células progenitoras neurais com características astrocíticos (chamados astrócitos SVZ), neuroblastos e células progenitoras intermediárias. Neuroblastos nascidos no SVZ tangencialmente migrar uma grande distância para o bulbo olfativo, onde se diferenciam em interneurônios. Sinalização através de moléculas de adesão intercelular e sinais difusíveis desempenham papéis importantes na neurogênese de controle. Muitos destes sinais de desencadear a actividade do cálcio intercelular, que transmite a informação dentro e entre as células. Actividade de cálcio é, portanto, reflexo da actividade de sinais extracelulares e é uma forma optimizada para compreender sinalização intercelular entre as células SVZ funcional. Actividade de cálcio foi estudada em diversas outras regiões e tipos de células, incluindo os astrócitos maduros e os neurónios. No entanto, o método tradicional de loacélulas D com cálcio indicador corante (ou seja, carga banho) não foi eficiente no carregamento de todos os tipos de células SVZ. De facto, a densidade celular no SVZ impede a difusão do corante dentro do tecido. Além disso, a preparação de cortes sagitais será melhor preservar o arranjo tridimensional de culas SVZ, particularmente o fluxo de migração dos neuroblastos no eixo rostral-caudal. Aqui, descrevemos métodos para preparar secções sagitais contendo o SVZ, o carregamento de culas SVZ com corante indicador de cálcio, e a aquisição da actividade de cálcio com lapso de tempo a filmes. Utilizou-Fluo-04:00 corante de carregamento astrócitos SVZ usando a aplicação de pressão no interior do tecido. Atividade de cálcio foi gravado utilizando um microscópio de varredura confocal permitindo uma resolução precisa para distinguir células individuais. A nossa abordagem é aplicável a outras zonas de origem neural, incluindo a zona do hipocampo adulto subgranular embrionárias e as zonas de origem neural. Além disso, outros tipos de corantes podeser aplicado utilizando o método descrito.

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Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Um método para carregar subventricular zona (SVZ) de células com corantes de cálcio indicador de actividade de cálcio gravação é descrito. A SVZ pós-natal contém células hermeticamente embalados, incluindo as células progenitoras neurais e neuroblastos. Ao invés de usar o carregamento banho foi injetado o corante por pressão dentro do tecido, permitindo uma melhor difusão de corante.

Preparação de fatias agudas zona subventricular for Imaging Cálcio

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow

A zona subventricular En face: Coloração Wholemount e Fluxo ependimárias

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an ...

Neurociência

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

Preparação de fatias do hipocampo aguda de ratos e camundongos transgênicos para o Estudo das Alterações Synaptic durante o envelhecimento e amilóide Patologia

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Lapso de tempo de imagem de migração neuroblastos em fatias agudas do cérebro anterior Rato Adulto

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Respostas de imagem de cálcio nos neurônios GFP-tagged fatias de cérebro de rato Hipotalâmicos

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Neonatal Subventricular Zone Electroporation

Eletroporação Zona Neonatal subventricular

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Eletroporação pós-natal e tempo-lapso de neuroblasto Migração na aguda fatias do cérebro do rato

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Seleção de células-tronco neurais de células progenitoras e do rato adulto subventricular Zone e Live-imagem de seus Dynamics com o ciclo celular

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Preparação de fatias de cérebro aguda usando um otimizado N-metil-D-método de proteção de recuperação glucamine

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

A incubação prolongada de aguda Neuronal Tissue de Eletrofisiologia e cálcio-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Imagem de dois fotões cálcio em dendritos neuronais no cérebro fatias

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...