Name: the green monster process for the generation of yeast strains carrying multiple gene deletions
Uploaded: 2012-12-15T15:03:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par la US Defense Advanced Research Projects Agency contrat N66001-12-C-4039 à YS, une subvention de la Fondation Alfred P. Sloan à RSL, et US National Institutes of Health des subventions R01 et R21 CA130266 HG003224 à FPRFPR était également soutenu par une bourse de l&#39;Institut canadien de recherches avancées et par le Programme des chaires de recherche du Canada excellence.

1. Génération de ProMonsters <ol><li> Préparer la cassette GFP universelle de remplacement en amplifiant un tetO 2-GFP marqueur et le marqueur URA3 du plasmide pYOGM012 (résistance à l&#39;ampicilline) en utilisant des amorces de séquences: GGATCCCCGGGTTAATTAAGGCGCGCCAGATCTGTTTAGCTTGCC CAAGCTCCTCGAGTAATTCG et GGCGTTAGTATCGAATCGACAGCAGTATAGCGACCAGCATTCAC GTACCGGGTAATAACTGATATAAT (régions en gras fournir une homologie avec les régions adjacent...

<ol>
	<li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants.">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science's STKE. 294, 2364-23 (2001).</li><li>Hillenmeyer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+genomic+portrait+of+yeast:+uncovering+a+phenotype+for+all+genes.">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li><li>Beh, C. T., Cool, L., Phillips, J., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+functions+of+the+yeast+oxysterol-binding+protein+homologues.">Overlapping functions of the yeast oxysterol-binding protein homologues.</a> Genetics. 157, 1117 (2001).</li><li>Wieczorke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+knock-out+of+at+least+20+transporter+genes+is+required+to+block+uptake+of+hexoses+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Concurrent knock-out of at least 20 transporter genes is required to block uptake of hexoses in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS letters. 464, 123-128 (1999).</li><li>Alani, E., Cao, L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+gene+disruption+that+allows+repeated+use+of+URA3+selection+in+the+construction+of+multiply+disrupted+yeast+strains.">A method for gene disruption that allows repeated use of URA3 selection in the construction of multiply disrupted yeast strains.</a> Genetics. 116, 541-545 (1987).</li><li>Akada, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-mediated+seamless+gene+deletion+and+marker+recycling+in+Saccharomyces+cerevisiae.">PCR-mediated seamless gene deletion and marker recycling in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23, 399-405 (2006).</li><li>Guldener, U., Heck, S., Fielder, T., Beinhauer, J., Hegemann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+efficient+gene+disruption+cassette+for+repeated+use+in+budding+yeast.">A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast.</a> Nucleic acids research. 24, 2519 (1996).</li><li>Delneri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+redundancy+in+the+yeast+genome:+an+improved+strategy+for+use+of+the+cre-loxP+system.">Exploring redundancy in the yeast genome: an improved strategy for use of the cre-loxP system.</a> Gene. 252, 127-135 (2000).</li><li>Storici, F., Lewis, L. K., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+site-directed+mutagenesis+using+oligonucleotides.">In vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides.</a> Nat. Biotech. 19, 773-776 (2001).</li><li>Noskov, V. N., Segall-Shapiro, T. H., Chuang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+repeat+coupled+with+endonuclease+cleavage+(TREC):+a+seamless+modification+tool+for+genome+engineering+in+yeast.">Tandem repeat coupled with endonuclease cleavage (TREC): a seamless modification tool for genome engineering in yeast.</a> Nucl. Acids Res. 38, 2570-2576 (2010).</li><li>Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knocking+out+multigene+redundancies+via+cycles+of+sexual+assortment+and+fluorescence+selection.">Knocking out multigene redundancies via cycles of sexual assortment and fluorescence selection.</a> Nat. Methods. 8, 159-164 (2011).</li><li>Winzeler, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Characterization+of+the+S.+Genome+by+Gene+Deletion+and+Parallel+Analysis.">Functional Characterization of the S. Genome by Gene Deletion and Parallel Analysis.</a> Science. 285, 901-906 (1999).</li><li>Woods, R. A., Gietz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transformation+of+plasmid+DNA+into+yeast.">High-efficiency transformation of plasmid DNA into yeast.</a> Methods Mol. Biol. 177, 85-97 (2001).</li><li>Hughes, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+aneuploidy+revealed+by+DNA+microarray+expression+profiling.">Widespread aneuploidy revealed by DNA microarray expression profiling.</a> Nature. 25, 333-337 (2000).</li><li>Goldstein, A. L., McCusker, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+new+dominant+drug+resistance+cassettes+for+gene+disruption+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 15, 1541-1553 (1999).</li><li>Newman, J. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+proteomic+analysis+of+S.+cerevisiae+reveals+the+architecture+of+biological+noise.">Single-cell proteomic analysis of S. cerevisiae reveals the architecture of biological noise.</a> Nature. 441, 840-846 (2006).</li><li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+at+the+single-cell+level.">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307, 1962 (2005).</li></ol>

Comme nous l&#39;avons développé l&#39;approche Green Monster, nous étions préoccupés par la possibilité d&#39;une recombinaison entre différentes cartouches de rechange GFP, ce qui conduit à un réarrangement du génome. Atténuer contre cette possibilité est notre sélection des cellules qui ont subi avec succès plusieurs séries d&#39;accouplement et de la méiose. Les cellules porteuses de génomes réarrangés sont censés être moins en forme après l&#39;accouplement aux cellules sans un réarrangement ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Le nom du réactif ou de l&#39;instrument </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A1720 </td><td> Dissoudre dans l&#39;eau et le filtre à stériliser (0,2 um filtre). Concentration Stock: 200 mg / ml. Stocker à 4 ° C. </td></tr><tr><td> ClonNAT (nourséothricine) </td><td> WERNER agents biologiques </td><td> 5001000 </td><td> Dissoudre dans l&#39;eau et le filtre à stériliser (0,2 um filtre). Concentration Stock: 100 mg / ml. Stocker à 4 ° C. </td></tr><tr><td> Doxycycline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9891 </td><td> Dissoudre dans de l&#39;éthanol à 50% et de filtrer les stériliser (0,2 um filtre). Concentration Stock: 10 mg / ml. Assurez frais toutes les quatre semaines. Bouclier de la lumière en utilisant du papier d&#39;aluminium et conserver à 4 ° C. </td></tr><tr><td> Zymolyase </td><td> ZymoResearch </td><td> E1005 </td><td></td></tr><tr><td> Difco yeast nitrogen base w / o acides aminés </td><td> BD </td><td> 291940 </td><td></td></tr><tr><td> Revolver (rotateur pour tubes) </td><td> Labnet </td><td> H5600 </td><td></td></tr><tr><td> Gel Enduro unité d&#39;électrophorèse XL </td><td> Labnet </td><td> E0160 </td><td></td></tr><tr><td> Sonifier 450 </td><td> Branson </td><td> 101-063-198 </td><td></td></tr><tr><td> Microtip pour Sonifier 450 </td><td> Branson </td><td> 101-148-062 </td><td></td></tr><tr><td> Trieur de cellules FACSAria </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Trieur de cellules MoFlo </td><td> Beckman-Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Biomek FX ou un robot équivalent </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td> Facultatif. Pour la mise en place de génotypage PCR. </td></tr></tbody> &lt;/ Table&gt;

the green monster process for the generation of yeast strains carrying multiple gene deletions

Phénotypes pour une délétion du gène sont souvent révélée que lorsque la mutation est testé dans un fond génétique particulier ou 1,2 état ​​de l&#39;environnement. Il ya des exemples où de nombreux gènes doivent être supprimés pour démasquer les fonctions des gènes cachés 3,4. Malgré le potentiel de découvertes importantes, les interactions génétiques impliquant trois ou plusieurs gènes sont en grande partie inexploré. Une recherche exhaustive de plusieurs mutants interactions serait impossible, en raison de la multiplicité des combinaisons possibles de suppressions. Cependant, les études d&#39;ensembles sélectionnés de gènes, tels que les jeux de paralogues avec une plus grande chance de partager priori une fonction commune, serait instructive. Dans la levure Saccharomyces cerevisiae, inactivation du gène est réalisée par le remplacement d&#39;un gène d&#39;un marqueur de sélection par recombinaison homologue. Parce que le nombre de marqueurs est limitée, des méthodes ont été développées pour enlever et réutiliser le sam<html> marqueur e 5,6,7,8,9,10. Cependant, les mutations d&#39;ingénierie séquentielle multiples en utilisant ces méthodes est temps parce que le temps nécessaire échelles linéairement avec le nombre de suppressions d&#39;être généré. Ici, nous décrivons la méthode de Green Monster régulièrement ingénierie suppressions multiples dans la levure 11. Dans cette méthode, une protéine fluorescente verte (GFP) journaliste intégré suppressions est utilisé pour les souches d&#39;étiquette quantitativement en fonction du nombre de suppressions contenues dans chaque souche (figure 1). Cycles répétés de gamme de la GFP marqués par des suppressions conjugaison de la levure et de la méiose couplé avec cytométrie de flux enrichissement de souches transportant plus de ces suppressions conduire à l&#39;accumulation de délétions dans des souches (figure 2). Effectuer des traitements multiples en parallèle, chaque processus comprenant une ou plusieurs délétions par tour, réduit le temps nécessaire pour la construction de la souche. contenu &quot;&gt; La première étape consiste à préparer haploïdes simples mutants appelé« ProMonsters, «dont chacun porte un rapporteur GFP dans un locus supprimé et l&#39;un des« boîte à outils »loci-soit-GMToolkit un monstre vert ou GMToolkit-α à l&#39; . can1Δ locus (figure 3) En utilisant des souches de la collection suppression de levure 12, GFP-marqués délétions peuvent être facilement généré par le remplacement de la cassette de kanMX4 commun qui sont dans ces souches avec une GFP universel - URA3 fragment Chaque GMToolkit contient:. supporte la une - ou α-accouplement du type spécifique de marqueur de sélection haploïde 1 et exactement un des deux marqueurs qui, lorsque les deux sont présents GMToolkits, collectivement permettent la sélection des diploïdes. La deuxième étape consiste à effectuer le cycle sexuel par lequel locus d&#39;effacement peuvent être combinés dans une seule cellule par l&#39;assortiment aléatoire et / ou recombinaison génétiques méiotiquemination qui accompagne chaque cycle de l&#39;accouplement et de la sporulation.

Quand une souche haploïde a-bord quatre suppressions GFP-marqués (ycl033cΔ yer042wΔ ykl069wΔ yol118cΔ) a été croisée avec une souche haploïde α-portant quatre suppressions (ycl033cΔ ydl242wΔ ydl227cΔ yer042wΔ), avec deux délétions (ycl033cΔ yer042wΔ) partagée par deux souches, un représentant résultat a été obtenu. Le mélange accouplement a été cultivée dans un milieu contenant du G418 YPDA et Nat pour sélectionner diploïdes. Les diploïdes obtenu...

Watch this Scientific Journal Video about The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions at JoVE.com

The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

La méthode de Green Monster permet l&#39;assemblage rapide de suppressions multiples marqués d&#39;un gène rapporteur codant pour la protéine fluorescente verte. Cette méthode est basée sur la conduite des souches de levures par des cycles répétés de l&#39;assortiment sexuelle des suppressions et basée sur la fluorescence d&#39;enrichissement de cellules portant des délétions plus.

Le processus de monstre vert pour la génération de souches de levure portant la délétion de gènes multiples

Phenotypes  for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a  particular genetic background or environmental condition1,2. ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

La préparation des cultures primaires de cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse murine pour l&#39;électroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Recherche

Biologie

Spinal Cord Electrophysiology

Spinal Cord électrophysiologie

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

La reconstitution in vitro de l&#39;actif T. La télomérase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Génération de souris dérivées de cellules souches pluripotentes induites

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

La délétion de gènes dans le génome entier<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Par PCR à haut débit

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Bourgeonnement de levure extraction et purification des protéines pour l&#39;étude de la fonction, Interactions, et des modifications post-traductionnelles

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

Nanogold étiquetage du système levure endosomique pour les analyses ultrastructurales

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Isoler Potentiated Hsp104 Variantes utilisant de la levure Proteinopathy modèles

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

Génération de suppressions génomiques dans des lignées cellulaires de mammifères via CRISPR / Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Applications de pHluorin pour Quantitative, Kinetic et à haut débit Analyse des endocytose dans la levure bourgeonnante

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...