Name: the green monster process for the generation of yeast strains carrying multiple gene deletions
Uploaded: 2012-12-15T15:03:00
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Diese Arbeit wurde von der US Defense Advanced Research Projects Agency Vertrag N66001-12-C-4039 um YS, einen Zuschuss von der Alfred P. Sloan Foundation, RSL, und US-amerikanischen National Institutes of Health Zuschüsse R01 HG003224 und R21 CA130266 um FPRFPR unterstützt wurde auch durch ein Stipendium vom kanadischen Institut für Advanced Research und von der Canada Exzellenzinitiative Forschung Chairs-Programm unterstützt.

Ein. Erzeugung ProMonsters <ol><li> Bereiten Sie die universelle GFP Austauschkassette durch Verstärken eines tetO 2-GFP-Marker und den URA3-Marker aus dem Plasmid pYOGM012 (Ampicillin-Resistenz) unter Verwendung der Primer mit Sequenzen: GGATCCCCGGGTTAATTAAGGCGCGCCAGATCTGTTTAGCTTGCC CAAGCTCCTCGAGTAATTCG und GGCGTTAGTATCGAATCGACAGCAGTATAGCGACCAGCATTCAC GTACCGGGTAATAACTGATATAAT (bolded Regionen bereitzustellen Homologie zu den flankierenden Regionen...

<ol>
	<li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants.">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science's STKE. 294, 2364-23 (2001).</li><li>Hillenmeyer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+genomic+portrait+of+yeast:+uncovering+a+phenotype+for+all+genes.">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li><li>Beh, C. T., Cool, L., Phillips, J., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+functions+of+the+yeast+oxysterol-binding+protein+homologues.">Overlapping functions of the yeast oxysterol-binding protein homologues.</a> Genetics. 157, 1117 (2001).</li><li>Wieczorke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+knock-out+of+at+least+20+transporter+genes+is+required+to+block+uptake+of+hexoses+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Concurrent knock-out of at least 20 transporter genes is required to block uptake of hexoses in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS letters. 464, 123-128 (1999).</li><li>Alani, E., Cao, L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+gene+disruption+that+allows+repeated+use+of+URA3+selection+in+the+construction+of+multiply+disrupted+yeast+strains.">A method for gene disruption that allows repeated use of URA3 selection in the construction of multiply disrupted yeast strains.</a> Genetics. 116, 541-545 (1987).</li><li>Akada, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-mediated+seamless+gene+deletion+and+marker+recycling+in+Saccharomyces+cerevisiae.">PCR-mediated seamless gene deletion and marker recycling in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23, 399-405 (2006).</li><li>Guldener, U., Heck, S., Fielder, T., Beinhauer, J., Hegemann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+efficient+gene+disruption+cassette+for+repeated+use+in+budding+yeast.">A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast.</a> Nucleic acids research. 24, 2519 (1996).</li><li>Delneri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+redundancy+in+the+yeast+genome:+an+improved+strategy+for+use+of+the+cre-loxP+system.">Exploring redundancy in the yeast genome: an improved strategy for use of the cre-loxP system.</a> Gene. 252, 127-135 (2000).</li><li>Storici, F., Lewis, L. K., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+site-directed+mutagenesis+using+oligonucleotides.">In vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides.</a> Nat. Biotech. 19, 773-776 (2001).</li><li>Noskov, V. N., Segall-Shapiro, T. H., Chuang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+repeat+coupled+with+endonuclease+cleavage+(TREC):+a+seamless+modification+tool+for+genome+engineering+in+yeast.">Tandem repeat coupled with endonuclease cleavage (TREC): a seamless modification tool for genome engineering in yeast.</a> Nucl. Acids Res. 38, 2570-2576 (2010).</li><li>Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knocking+out+multigene+redundancies+via+cycles+of+sexual+assortment+and+fluorescence+selection.">Knocking out multigene redundancies via cycles of sexual assortment and fluorescence selection.</a> Nat. Methods. 8, 159-164 (2011).</li><li>Winzeler, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Characterization+of+the+S.+Genome+by+Gene+Deletion+and+Parallel+Analysis.">Functional Characterization of the S. Genome by Gene Deletion and Parallel Analysis.</a> Science. 285, 901-906 (1999).</li><li>Woods, R. A., Gietz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transformation+of+plasmid+DNA+into+yeast.">High-efficiency transformation of plasmid DNA into yeast.</a> Methods Mol. Biol. 177, 85-97 (2001).</li><li>Hughes, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+aneuploidy+revealed+by+DNA+microarray+expression+profiling.">Widespread aneuploidy revealed by DNA microarray expression profiling.</a> Nature. 25, 333-337 (2000).</li><li>Goldstein, A. L., McCusker, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+new+dominant+drug+resistance+cassettes+for+gene+disruption+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 15, 1541-1553 (1999).</li><li>Newman, J. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+proteomic+analysis+of+S.+cerevisiae+reveals+the+architecture+of+biological+noise.">Single-cell proteomic analysis of S. cerevisiae reveals the architecture of biological noise.</a> Nature. 441, 840-846 (2006).</li><li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+at+the+single-cell+level.">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307, 1962 (2005).</li></ol>

Als wir das Green Monster Ansatz entwickelt, wurden wir mit der Möglichkeit der Rekombination zwischen verschiedenen GFP Ersatzkassetten betroffenen, was zu Genom-Umlagerung. Milderung gegen diese Möglichkeit ist unsere Auswahl für Zellen, die erfolgreich mehrere Runden der Paarung und Meiose durchlaufen haben. Zellen, die umgeordnet Genome sind voraussichtlich weniger fit nach der Paarung zu Zellen ohne eine identische Umlagerung. In der Tat haben wir nicht beobachten Genominstabilität aus Rekombination zwischen GF...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagens oder des Instruments </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A1720 </td><td> In Wasser auflösen und Filter-sterilisiert (0,2-um-Filter). Lager-Konzentration: 200 mg / ml. Lagerung bei 4 ° C. </td></tr><tr><td> ClonNAT (Nourseothricin) </td><td> WERNER BioAgents </td><td> 5001000 </td><td> In Wasser auflösen und Filter-sterilisiert (0,2-um-Filter). Lager-Konzentration: 100 mg / ml. Lagerung bei 4 ° C. </td></tr><tr><td> Doxycycline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9891 </td><td> Lösen Sie in 50% Ethanol und filtern sterilisieren (0,2-um-Filter). Lager Konzentration: 10 mg / ml. Stellen Sie frische alle vier Wochen. Abschirmung von Licht mit Aluminiumfolie und bei 4 ° C. </td></tr><tr><td> Zymolyase </td><td> ZymoResearch </td><td> E1005 </td><td></td></tr><tr><td> Difco Yeast Nitrogen Base w / o Aminosäuren </td><td> BD </td><td> 291940 </td><td></td></tr><tr><td> Revolver (Rotator für Rohre) </td><td> Labnet </td><td> H5600 </td><td></td></tr><tr><td> Enduro Gel XL Elektrophorese-Einheit </td><td> Labnet </td><td> E0160 </td><td></td></tr><tr><td> Sonifier 450 </td><td> Branson </td><td> 101-063-198 </td><td></td></tr><tr><td> Mikrospitze für Sonifier 450 </td><td> Branson </td><td> 101-148-062 </td><td></td></tr><tr><td> FACSAria Zellsortierer </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MoFlo Zellsortierer </td><td> Beckman-Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Biomek FX oder gleichwertig Roboter </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td> Optional. Für den Aufbau Genotypisierung PCRs. </td></tr></tbody> &lt;/ Table&gt;

the green monster process for the generation of yeast strains carrying multiple gene deletions

Phänotypen für eine Gendeletion angesehen offenbart nur, wenn die Mutation in einem bestimmten genetischen Hintergrund oder Umgebungsbedingung 1,2 getestet wird. Es gibt Beispiele, wo viele Gene müssen gelöscht zu entlarven versteckte Genfunktionen 3,4 werden. Trotz des Potenzials für wichtige Entdeckungen werden genetische Interaktionen mit drei oder mehr Gene weitgehend unerforscht. Ausgiebige Recherchen Multi-Mutante Interaktionen wäre unpraktisch aufgrund der schieren Anzahl der möglichen Kombinationen von Deletionen. Jedoch würde Untersuchungen ausgewählter Sätze von Genen wie Sätze von Paraloge mit einer größeren Wahrscheinlichkeit von vornherein mit einer gemeinsamen Funktion, informativ sein. In der Hefe Saccharomyces cerevisiae, wird Gen-Knockout durch Ersetzen eines Gens mit einem selektierbaren Marker über homologe Rekombination erfolgt. Da die Anzahl der Markierungen begrenzt ist, wurden Verfahren zum Entfernen und Wiederverwenden des sam entwickelt<html> e Marker 5,6,7,8,9,10. Jedoch ist sequentiell Engineering multiple Mutationen unter Verwendung dieser Verfahren zeitaufwendig, da die Zeit linear mit der Anzahl der Löschungen zu erzeugenden erforderlich. Hier beschreiben wir die Green Monster Verfahren für die routinemäßige Engineering multiple Deletionen in Hefe 11. In diesem Verfahren wird ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) Reporters in Deletionen integriert quantitativ Etikett Stämme gemäß der Anzahl von Deletionen in jedem Stamm enthielten (Abb. 1) verwendet. Wiederholte Runden des Sortiments von GFP-markierten Deletionen über Hefe Paarung und Meiose mit durchflusszytometrische Anreicherung von Stämmen mit mehreren dieser Deletionen führen zu einer Anhäufung von Deletionen in Stämmen (Abbildung 2) gekoppelt ist. Durchführen mehrerer Prozesse parallel mit jedem Prozess, die eine oder mehrere Deletionen pro Runde, verringert die für die Stamm Konstruktion erforderlich. Inhalt &quot;&gt; Der erste Schritt zur Vorbereitung haploid Single-Mutanten genannt ist &#39;ProMonsters,&#39; von denen jeder trägt einen GFP-Reporter in einem gelöschten Locus und einer der&quot; Toolkit &quot;loci, entweder Green Monster GMToolkit-a oder GMToolkit-α an der . can1Δ Locus (Abbildung 3) Verwenden von Stämmen aus der Hefe Deletion Sammlung 12 kann GFP-markierten Deletionen zweckmäßigerweise durch Ersetzen des existierenden gemeinsamen kanMX4 Kassette in diesen Stämmen mit einem Universal-GFP generiert - URA3 Fragment Jeder GMToolkit enthält:. entweder der a - oder α-Mating-typspezifischen haploiden Selektionsmarker 1 und genau eine der beiden Marker, dass, wenn beide GMToolkits vorhanden sind, kollektiv für die Auswahl der Diploide ermöglichen. Der zweite Schritt besteht in der Durchführung der sexuellen Rad durch die Deletion Loci innerhalb einer einzelnen Zelle durch den zufälligen Auswahl und / oder meiotischen Recomb kombinierbarination, die jeden Zyklus der Paarung und Sporulation begleitet.

Wenn eine a-haploide Stamm, der vier GFP-markierten Deletionen (ycl033cΔ yer042wΔ ykl069wΔ yol118cΔ) wurde mit einem α-haploide Stamm, der vier Deletionen gekreuzt (ycl033cΔ ydl242wΔ ydl227cΔ yer042wΔ), mit zwei Deletionen (ycl033cΔ yer042wΔ) von zwei Stämmen, ein Vertreter geteilt Ergebnis wurde erzielt. Die Paarung Mischung wurde in YPDA Medium mit G418 und Nat Diploiden wählen kultiviert. Die resultierenden Diploide wurden in Sporulationsmedium kultiviert. Die ...

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The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

Das Green Monster Verfahren ermöglicht die schnelle Montage mehrerer Deletionen mit einem Reporter-Gen kodiert grün fluoreszierendes Protein markiert. Dieses Verfahren basiert auf der Fahrt Hefestämme durch wiederholte Zyklen von sexueller Sortiment von Deletionen und Fluoreszenz-basierter Anreicherung von Zellen, die mehrere Deletionen basiert.

The Green Monster Verfahren zur Erzeugung von Hefestämmen Buchwert Multiple Deletionen

Phenotypes  for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a  particular genetic background or environmental condition1,2. ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Forschung

Biologie

Spinal Cord Electrophysiology

Spinal Cord Elektrophysiologie

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

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In vitro Rekonstitution der Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genomweiten Gen-Deletionen in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Von High Throughput PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Bäckerhefe Protein Extraktion und Reinigung für das Studium der Funktion, Wechselwirkungen, und post-translationale Modifikationen

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

Nanogold Markierung der Hefe Endosomale System für Ultrastrukturanalysen

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Isolieren Potenzierte Hsp104 Varianten unter Verwendung von Hefe Proteinopathy Models

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

Generierung von Genomic Löschungen in Säugerzelllinien über CRISPR / Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Anwendungen von pHluorin für Quantitative, Kinetic und Hochdurchsatz-Analyse von Endozytose in Bäckerhefe

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...