Name: the green monster process for the generation of yeast strains carrying multiple gene deletions
Uploaded: 2012-12-15T15:03:00
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この作品はFPRFPRにYSは、RSLにアルフレッド·P·スローン財団からの助成金、そして健康の助成金は、米国国立衛生研究所R01 HG003224とR21 CA130266に米国国防総省の国防高等研究計画庁契約N66001-12-C-4039でサポートされていたことだったまた、先端研究のためのカナダの研究所からの交わりによっておよびカナダの優秀研究チェアプログラムでサポートされている。

1。 ProMonstersの世代<ol><li> テト2-GFPマーカーおよび配列を有するプライマーを用いてプラスミドpYOGM012（アンピシリン耐性）からURA3マーカーを増幅することによって、普遍的なGFPの交換用カセットを準備します。 GGATCCCCGGGTTAATTAAGGCGCGCCAGATCTGTTTAGCTTGCC CAAGCTCCTCGAGTAATTCGとGGCGTTAGTATCGAATCGACAGCAGTATAGCGACCAGCATTCAC GTACCGGGTAATAACTGATATAAT（太字の地域をターゲ?...

<ol>
	<li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants.">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science's STKE. 294, 2364-23 (2001).</li><li>Hillenmeyer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+genomic+portrait+of+yeast:+uncovering+a+phenotype+for+all+genes.">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li><li>Beh, C. T., Cool, L., Phillips, J., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+functions+of+the+yeast+oxysterol-binding+protein+homologues.">Overlapping functions of the yeast oxysterol-binding protein homologues.</a> Genetics. 157, 1117 (2001).</li><li>Wieczorke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+knock-out+of+at+least+20+transporter+genes+is+required+to+block+uptake+of+hexoses+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Concurrent knock-out of at least 20 transporter genes is required to block uptake of hexoses in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS letters. 464, 123-128 (1999).</li><li>Alani, E., Cao, L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+gene+disruption+that+allows+repeated+use+of+URA3+selection+in+the+construction+of+multiply+disrupted+yeast+strains.">A method for gene disruption that allows repeated use of URA3 selection in the construction of multiply disrupted yeast strains.</a> Genetics. 116, 541-545 (1987).</li><li>Akada, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-mediated+seamless+gene+deletion+and+marker+recycling+in+Saccharomyces+cerevisiae.">PCR-mediated seamless gene deletion and marker recycling in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23, 399-405 (2006).</li><li>Guldener, U., Heck, S., Fielder, T., Beinhauer, J., Hegemann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+efficient+gene+disruption+cassette+for+repeated+use+in+budding+yeast.">A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast.</a> Nucleic acids research. 24, 2519 (1996).</li><li>Delneri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+redundancy+in+the+yeast+genome:+an+improved+strategy+for+use+of+the+cre-loxP+system.">Exploring redundancy in the yeast genome: an improved strategy for use of the cre-loxP system.</a> Gene. 252, 127-135 (2000).</li><li>Storici, F., Lewis, L. K., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+site-directed+mutagenesis+using+oligonucleotides.">In vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides.</a> Nat. Biotech. 19, 773-776 (2001).</li><li>Noskov, V. N., Segall-Shapiro, T. H., Chuang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+repeat+coupled+with+endonuclease+cleavage+(TREC):+a+seamless+modification+tool+for+genome+engineering+in+yeast.">Tandem repeat coupled with endonuclease cleavage (TREC): a seamless modification tool for genome engineering in yeast.</a> Nucl. Acids Res. 38, 2570-2576 (2010).</li><li>Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knocking+out+multigene+redundancies+via+cycles+of+sexual+assortment+and+fluorescence+selection.">Knocking out multigene redundancies via cycles of sexual assortment and fluorescence selection.</a> Nat. Methods. 8, 159-164 (2011).</li><li>Winzeler, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Characterization+of+the+S.+Genome+by+Gene+Deletion+and+Parallel+Analysis.">Functional Characterization of the S. Genome by Gene Deletion and Parallel Analysis.</a> Science. 285, 901-906 (1999).</li><li>Woods, R. A., Gietz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transformation+of+plasmid+DNA+into+yeast.">High-efficiency transformation of plasmid DNA into yeast.</a> Methods Mol. Biol. 177, 85-97 (2001).</li><li>Hughes, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+aneuploidy+revealed+by+DNA+microarray+expression+profiling.">Widespread aneuploidy revealed by DNA microarray expression profiling.</a> Nature. 25, 333-337 (2000).</li><li>Goldstein, A. L., McCusker, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+new+dominant+drug+resistance+cassettes+for+gene+disruption+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 15, 1541-1553 (1999).</li><li>Newman, J. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+proteomic+analysis+of+S.+cerevisiae+reveals+the+architecture+of+biological+noise.">Single-cell proteomic analysis of S. cerevisiae reveals the architecture of biological noise.</a> Nature. 441, 840-846 (2006).</li><li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+at+the+single-cell+level.">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307, 1962 (2005).</li></ol>

我々はグリーンモンスターアプローチを開発したように、我々は、ゲノム再編成につながる、異なるGFPの交換カセット間の組換えの可能性に関心を持っていた。このような事態を軽減することに成功交配と減数分裂の複数のラウンドを受けた細胞のための私達の選択である。再配列ゲノムを持つ細胞は、同一の再調整なしに細胞に交配後少なくフィットすることが期待されています。実際、?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬や器具の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> G418 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A1720 </td><td> （0.2μmフィルター）を水に溶解し、フィルター滅菌してください。ストック濃度：200 mg / mlである。 4℃で保存する</td></tr><tr><td> ClonNAT（nourseothricin） </td><td>ヴェルナー生体物質</td><td> 5001000 </td><td> （0.2μmフィルター）を水に溶解し、フィルター滅菌してください。ストック濃度：100 mg / mlである。 4℃で保存する</td></tr><tr><td>ドキシサイクリン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D9891 </td><td> 50％エタノールに溶解し、フィルター滅菌（0.2μmフィルター）。ストック濃度：10 mg / mlである。 4週間ごとに新鮮なことを確認します。 4でアルミ箔とストアを使用して光からシールド℃の</td></tr><tr><td>ザイモリアーゼ</td><td> ZymoResearch </td><td> E1005 </td><td></td></tr><tr><td> Difco酵母窒素ベースW / Oアミノ酸</td><td> BD </td><td> 291940 </td><td></td></tr><tr><td>リボルバー（チューブ用回転子） </td><td> Labnet </td><td> H5600 </td><td></td></tr><tr><td>エンデューロジェルXLの電気泳動装置</td><td> Labnet </td><td> E0160 </td><td></td></tr><tr><td>ソニファイアー450 </td><td>ブランソン</td><td> 101-063-198 </td><td></td></tr><tr><td>ソニファイアー450用マイクロチップ</td><td>ブランソン</td><td> 101-148-062 </td><td></td></tr><tr><td> FACSAriaセルソーター</td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MoFloセルソーター</td><td>ベックマン·コールター- </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Biomek FXまたは同等のロボット</td><td>ベックマン·コールター</td><td></td><td>オプション。ジェノタイピングPCRを設定するため。 </td></tr></tbody> &lt;/ TABLE&gt;

the green monster process for the generation of yeast strains carrying multiple gene deletions

遺伝子欠失のための表現型は、しばしば突然変異が特定の遺伝的背景や環境条件1,2でテストされているときにのみ明らかにされています。多くの遺伝子が隠された遺伝子の機能3,4のマスクを解除するために削除する必要がある例があります。重要な発見の可能性にもかかわらず、3つ以上の遺伝子が関与する遺伝的相互作用は、主に未踏されています。マルチ変異体の相互作用の網羅的な検索が欠失の可能な組み合わせの膨大な数のために現実的ではありません。しかし、このような共通機能を共有することの大きいアプリオリの確率でパラログのセットなどの遺伝子の選択セットの研究は、有益であろう。 酵母 Saccharomyces cerevisiaeにおいて、遺伝子ノックアウトは、相同組換えを介した選択マーカーと遺伝子を交換することによって達成されます。マーカーの数が限られているので、このメソッドでは、SAMを削除し、再利用のために開発されている<html>電子マーカー5,6,7,8,9,10。時間が生成される削除の数に比例して直線的に必要なので、これらのメソッドを使用して順次工学複数の変異は時間がかかります。 ここでは、日常的に酵母11に複数の削除を工学のためのグリーンモンスター方法を説明します。この方法では、削除に統合された緑色蛍光タンパク質（GFP）レポーターが定量的に各菌株に含まれる削除の数（ 図1）に記載の菌株にラベルを付けるために使用されています。これらの欠失の多くを運ぶ株のフローサイトメトリー濃縮と相まって酵母の接合と減数分裂を経由して、GFP-著しい失の品揃えの繰り返しラウンドは株の欠失（ 図2）の蓄積につながる。各プロセスがラウンドごとに1つ以上の欠失を組み込むとともに、並行して複数のプロセスを実行し、ひずみ建設に必要な時間が短縮されます。 GFPの削除された遺伝子座でのレポーターや&quot;ツールキット&quot;座·どちらグリーンモンスターGMToolkitまたは少なくともGMToolkit-αの1を運びそれぞれのコンテンツは、 &quot;&gt;と呼ばれる最初のステップは、半数体、単変異体を作製することは&#39;ProMonsters、&#39; can1Δ軌跡（ 図3）酵母削除コレクション12から菌株を用い、GFP顕著な欠失が便利なユニバーサルGFPでこれらの株に存在する共通のKanMX4カセット交換することによって生成することができます- URA3断片を各GMToolkitが含まれています。どちらか-またはα接合型特異半数体選択マーカー1とその2つのマーカーのちょうど1つ、両方GMToolkitsが存在する場合に、一括して二倍体の選択を可能にする。 第二段階は、欠失遺伝子座がランダムな組み合わせ、および/または減数recombにより単一細胞内で組み合わせることができるような性的サイクリングを実施することである交配と胞子形成の各サイクルを伴うもののみ。

4、GFP-著しい欠損を（ycl033cΔyer042wΔykl069wΔyol118cΔ）を運ぶのa-ハプロイド株は4失を運ぶのα-ハプロイド株と交配したとき（ycl033cΔydl242wΔydl227cΔyer042wΔ）、2つの欠失を持つ（ycl033cΔyer042wΔ）2系統、代表で共有結果が得られた。交配混合物は、二倍体を選択するには、G418およびNATを含むYPDA培地で培養した。結果として二倍体は、胞子形成培地で培養した。胞子?...

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The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

グリーンモンスターメソッドは、緑色蛍光タンパク質をコードするレポーター遺伝子でマークされた複数の削除を迅速に組み立てることができます。このメソッドは、性的失の品揃えや、その他の欠失を保有する細胞の蛍光ベースの濃縮の繰り返しサイクルを通して酵母菌株を駆動に基づいています。

複数の遺伝子欠失を持つ酵母菌株の世代のためのグリーンモンスタープロセス

Phenotypes  for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a  particular genetic background or environmental condition1,2. ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

エレクトロポレーションのためのマウス骨髄からの一次造血細胞培養の準備

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Spinal Cord Electrophysiology

脊髄電気生理学

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

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アクティブT.の試験管内再構成でcastaneumのテロメラーゼ

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

人工多能性幹細胞に由来するマウスの作製

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

ゲノムワイドな遺伝子欠失で<em&gt;ストレプトコッカス血統</em&gt;ハイスループットPCRによる

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

機能の研究、相互作用、および翻訳後修飾のため出芽酵母タンパク質の抽出と精製

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

超微細構造解析のための酵母エンドソーム系のナノゴールドラベル付け

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

酵母Proteinopathyモデルを用いた増強Hsp104のバリアントを分離

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

CRISPR / Cas9経由哺乳動物細胞株におけるゲノム欠失の生成

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

出芽酵母におけるエンドサイトーシスの定量的、動力学的およびハイスループット分析のためのpHluorinの応用

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...