Name: the green monster process for the generation of yeast strains carrying multiple gene deletions
Uploaded: 2012-12-15T15:03:00
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Este trabalho foi financiado pela Defense Advanced Research Projects Agency EUA contrato N66001-12-C-4039 a YS, uma bolsa da Fundação Alfred P. Sloan para RSL, e Nacional dos EUA Institutos de bolsas de Saúde HG003224 R01 e R21 CA130266 para FPRFPR foi também apoiado por uma bolsa de estudos do Instituto Canadense de Pesquisas Avançadas e pelo programa de Excelência de Pesquisa do Canadá Cadeiras.

1. Geração de ProMonsters <ol><li> Prepare a cassete de substituição universal GFP, amplificando um tetO 2-GFP marcador e o marcador URA3 a partir do plasmídeo pYOGM012 (resistência à ampicilina), utilizando iniciadores com sequências: GGATCCCCGGGTTAATTAAGGCGCGCCAGATCTGTTTAGCTTGCC CAAGCTCCTCGAGTAATTCG e GGCGTTAGTATCGAATCGACAGCAGTATAGCGACCAGCATTCAC GTACCGGGTAATAACTGATATAAT (regiões negrito proporcionar homologia com as regiões flanqueadoras...

<ol>
	<li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants.">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science's STKE. 294, 2364-23 (2001).</li><li>Hillenmeyer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+genomic+portrait+of+yeast:+uncovering+a+phenotype+for+all+genes.">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li><li>Beh, C. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transformation+of+plasmid+DNA+into+yeast.">High-efficiency transformation of plasmid DNA into yeast.</a> Methods Mol. Biol. 177, 85-97 (2001).</li><li>Hughes, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+aneuploidy+revealed+by+DNA+microarray+expression+profiling.">Widespread aneuploidy revealed by DNA microarray expression profiling.</a> Nature. 25, 333-337 (2000).</li><li>Goldstein, A. L., McCusker, J. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+at+the+single-cell+level.">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307, 1962 (2005).</li></ol>

Como se desenvolveu a abordagem monstro verde, estávamos preocupados com a possibilidade de recombinação entre cassetes de substituição diferentes GFP, levando ao rearranjo do genoma. Mitigação contra esta possibilidade é a nossa seleção para as células que resistiram várias rodadas de acasalamento e meiose. Células portadoras de genomas rearranjados se espera que sejam menos aptos após o acasalamento para células sem um rearranjo idênticos. Na verdade, não observamos qualquer instabilidade do genoma re...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente ou instrumento </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A1720 </td><td> Dissolver em água e esterilizar por filtração (0,2-nm). Concentração de Stock: 200 mg / ml. Armazenar a 4 ° C. </td></tr><tr><td> ClonNAT (nourseothricin) </td><td> WERNER Bioagentes </td><td> 5001000 </td><td> Dissolver em água e esterilizar por filtração (0,2-nm). Concentração de Stock: 100 mg / ml. Armazenar a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Doxiciclina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9891 </td><td> Dissolve-se em etanol a 50% e filtrar-esterilizar (0,2-nm). Concentração de Stock: 10 mg / ml. Fazer fresco a cada quatro semanas. Escudo de luz, utilizando uma folha de alumínio e armazenar a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Zymolyase </td><td> ZymoResearch </td><td> E1005 </td><td></td></tr><tr><td> Base de azoto de levedura Disco com / sem aminoácidos </td><td> BD </td><td> 291940 </td><td></td></tr><tr><td> (Rotator para tubos) Revolver </td><td> Labnet </td><td> H5600 </td><td></td></tr><tr><td> Enduro Gel eletroforese XL </td><td> Labnet </td><td> E0160 </td><td></td></tr><tr><td> Sonifier 450 </td><td> Branson </td><td> 101-063-198 </td><td></td></tr><tr><td> Microtip para Sonifier 450 </td><td> Branson </td><td> 101-148-062 </td><td></td></tr><tr><td> FACSAria seleccionador de células </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MoFlo seleccionador de células </td><td> Beckman-Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Biomek FX ou equivalente robô </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td> Opcional. Para a criação de PCRs de genotipagem. </td></tr></tbody> &lt;/ Table&gt;

the green monster process for the generation of yeast strains carrying multiple gene deletions

Fenótipos de uma deleção do gene são frequentemente revela apenas quando a mutação é testado em um fundo genético particular ou 1,2 condição ambiental. Há exemplos em que muitos genes precisam ser apagados para desmascarar funções de genes ocultos 3,4. Apesar do potencial de descobertas importantes, interações genéticas envolvendo três ou mais genes são largamente inexplorado. Buscas exaustivas de multi-mutantes interações seria inviável devido ao grande número de combinações possíveis de exclusões. No entanto, os estudos de conjuntos de genes seleccionados, tais como conjuntos de parálogos com maior probabilidade a priori de uma partilha uma função comum, seria informativo. Na levedura Saccharomyces cerevisiae, knockout do gene é realizada por substituição de um gene com um marcador seleccionável através de recombinação homóloga. Devido ao número de marcadores é limitada, foram desenvolvidos métodos para a remoção e reutilização do sam<html> e marcador 5,6,7,8,9,10. No entanto, as mutações de engenharia sequencialmente múltiplas usando esses métodos é demorado porque o tempo necessário escalas linearmente com o número de deleções a ser gerado. Aqui descrevemos o método monstro verde para rotineiramente a engenharia de exclusões múltiplas na levedura 11. Neste método, a proteína verde fluorescente repórter (GFP) integrado deleções é usado para estirpes quantitativamente etiquetas de acordo com o número de deleções contidos em cada estirpe (Figura 1). Ciclos repetidos de sortimento de GFP-marcados através de deleções de acasalamento de levedura e meiose acoplado com fluxo de citometria de enriquecimento de estirpes que transportem mais dessas supressões levar à acumulação de deleções em estirpes (Figura 2). Realizando vários processos em paralelo, com cada processo de incorporação de um ou mais deleções por rodada, reduz o tempo necessário para a construção da estirpe. conteúdo &quot;&gt; O primeiro passo consiste em preparar um único mutantes haplóides denominado« ProMonsters &#39;, cada um dos quais transporta um repórter GFP em um locus suprimido e um dos &quot;kit de ferramentas&quot; loci-ou-GMToolkit um monstro verde ou GMToolkit-α no . can1Δ locus (Figura 3) usando as estirpes de levedura a supressão recolha 12, GFP marcadas deleções pode ser convenientemente gerado pela substituição da cassete KanMX4 comum existente nessas estirpes com uma GFP universal - URA3 Cada fragmento GMToolkit contém:. quer a um - ou α-acasalamento tipo específico de marca de selecção haplóide 1 e exatamente um dos dois marcadores que, quando ambos estão presentes GMToolkits, coletivamente permitem a selecção de diplóides. O segundo passo é fazer o ciclo sexual por meio do qual loci deleção podem ser combinados dentro de uma única célula, a distribuição aleatória e / ou recomb meióticaminação que acompanha cada ciclo de acasalamento e esporulação.

Quando uma tensão a-haplóide com quatro eliminações GFP-marcados (ycl033cΔ yer042wΔ ykl069wΔ yol118cΔ) foi cruzado com uma tensão α-haplóide com quatro eliminações (ycl033cΔ ydl242wΔ ydl227cΔ yer042wΔ), com duas eliminações (ycl033cΔ yer042wΔ) compartilhado por duas estirpes, um representante resultado foi obtido. A mistura de acasalamento foi cultivada em meio contendo YPDA G418 e Nat para selecionar diplóides. Os diplóides resultantes foram cultivadas ...

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The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

O método permite que o monstro verde montagem rápida de exclusões múltiplas marcados com um gene que codifica a proteína verde fluorescente repórter. Este método baseia-se em estirpes de levedura de condução através de ciclos repetidos de sortimento sexual de deleções e fluorescência baseada enriquecimento de células que transportem mais deleções.

O Processo de monstro verde para a Geração de linhagens de levedura de transporte deleções de genes múltiplos

Phenotypes  for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a  particular genetic background or environmental condition1,2. ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Biologia

Spinal Cord Electrophysiology

Spinal Cord Eletrofisiologia

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Na reconstituição in vitro da atividade T. Telomerase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Do genoma deleções de genes em<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Por PCR de Alto Rendimento

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Brotando Yeast extração e purificação de proteínas para o estudo da função, interações e modificações pós-traducionais

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

Nanogold Labeling do Sistema de levedura Endossomal de Análises ultraestruturais

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Isolando potencializado Hsp104 variantes usando levedura Proteinopathy Models

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

Geração de Deleções Genômicas em Linhagens de Células de Mamíferos via CRISPR/Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Aplicações de pHluorin para Quantitative, Kinetic e de alta capacidade: Análise de endocitose em brotamento Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...