Name: the green monster process for the generation of yeast strains carrying multiple gene deletions
Uploaded: 2012-12-15T15:03:00
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Este trabajo fue apoyado por el contrato de EE.UU. Defense Advanced Research Projects Agency N66001-12-C-4039 a YS, una beca de la Fundación Alfred P. Sloan para RSL, y los EE.UU. Institutos Nacionales de Salud subvenciones R01 R21 CA130266 HG003224 y fue a FPRFPR también con el apoyo de una beca del Instituto Canadiense para la Investigación Avanzada y por la excelencia Canada Research Chairs programa.

1. Generación de ProMonsters <ol><li> Preparar el casete GFP reemplazo universal mediante la amplificación de un tetO 2-GFP marcador y el marcador URA3 a partir del plásmido pYOGM012 (resistencia a ampicilina) usando cebadores con secuencias: GGATCCCCGGGTTAATTAAGGCGCGCCAGATCTGTTTAGCTTGCC CAAGCTCCTCGAGTAATTCG y GTACCGGGTAATAACTGATATAAT GGCGTTAGTATCGAATCGACAGCAGTATAGCGACCAGCATTCAC (regiones en negrita proporcionar homología con las regiones flanqu...

<ol>
	<li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants.">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science's STKE. 294, 2364-23 (2001).</li><li>Hillenmeyer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+genomic+portrait+of+yeast:+uncovering+a+phenotype+for+all+genes.">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li><li>Beh, C. T., Cool, L., Phillips, J., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+functions+of+the+yeast+oxysterol-binding+protein+homologues.">Overlapping functions of the yeast oxysterol-binding protein homologues.</a> Genetics. 157, 1117 (2001).</li><li>Wieczorke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+knock-out+of+at+least+20+transporter+genes+is+required+to+block+uptake+of+hexoses+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Concurrent knock-out of at least 20 transporter genes is required to block uptake of hexoses in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS letters. 464, 123-128 (1999).</li><li>Alani, E., Cao, L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+gene+disruption+that+allows+repeated+use+of+URA3+selection+in+the+construction+of+multiply+disrupted+yeast+strains.">A method for gene disruption that allows repeated use of URA3 selection in the construction of multiply disrupted yeast strains.</a> Genetics. 116, 541-545 (1987).</li><li>Akada, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-mediated+seamless+gene+deletion+and+marker+recycling+in+Saccharomyces+cerevisiae.">PCR-mediated seamless gene deletion and marker recycling in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23, 399-405 (2006).</li><li>Guldener, U., Heck, S., Fielder, T., Beinhauer, J., Hegemann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+efficient+gene+disruption+cassette+for+repeated+use+in+budding+yeast.">A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast.</a> Nucleic acids research. 24, 2519 (1996).</li><li>Delneri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+redundancy+in+the+yeast+genome:+an+improved+strategy+for+use+of+the+cre-loxP+system.">Exploring redundancy in the yeast genome: an improved strategy for use of the cre-loxP system.</a> Gene. 252, 127-135 (2000).</li><li>Storici, F., Lewis, L. K., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+site-directed+mutagenesis+using+oligonucleotides.">In vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides.</a> Nat. Biotech. 19, 773-776 (2001).</li><li>Noskov, V. N., Segall-Shapiro, T. H., Chuang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+repeat+coupled+with+endonuclease+cleavage+(TREC):+a+seamless+modification+tool+for+genome+engineering+in+yeast.">Tandem repeat coupled with endonuclease cleavage (TREC): a seamless modification tool for genome engineering in yeast.</a> Nucl. Acids Res. 38, 2570-2576 (2010).</li><li>Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knocking+out+multigene+redundancies+via+cycles+of+sexual+assortment+and+fluorescence+selection.">Knocking out multigene redundancies via cycles of sexual assortment and fluorescence selection.</a> Nat. Methods. 8, 159-164 (2011).</li><li>Winzeler, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Characterization+of+the+S.+Genome+by+Gene+Deletion+and+Parallel+Analysis.">Functional Characterization of the S. Genome by Gene Deletion and Parallel Analysis.</a> Science. 285, 901-906 (1999).</li><li>Woods, R. A., Gietz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transformation+of+plasmid+DNA+into+yeast.">High-efficiency transformation of plasmid DNA into yeast.</a> Methods Mol. Biol. 177, 85-97 (2001).</li><li>Hughes, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+aneuploidy+revealed+by+DNA+microarray+expression+profiling.">Widespread aneuploidy revealed by DNA microarray expression profiling.</a> Nature. 25, 333-337 (2000).</li><li>Goldstein, A. L., McCusker, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+new+dominant+drug+resistance+cassettes+for+gene+disruption+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 15, 1541-1553 (1999).</li><li>Newman, J. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+proteomic+analysis+of+S.+cerevisiae+reveals+the+architecture+of+biological+noise.">Single-cell proteomic analysis of S. cerevisiae reveals the architecture of biological noise.</a> Nature. 441, 840-846 (2006).</li><li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+at+the+single-cell+level.">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307, 1962 (2005).</li></ol>

A medida que desarrollamos el enfoque Monstruo Verde, estábamos preocupados con la posibilidad de recombinación entre diferentes cassettes GFP reemplazo, lo que lleva a la reordenación del genoma. Mitigar contra de esta posibilidad es nuestra selección para las células que han superado con éxito múltiples rondas de apareamiento y la meiosis. Las células que llevan genomas reordenados se espera que sean menos aptos después del apareamiento con las células sin un reordenamiento idénticos. En efecto, no se obser...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo o instrumento </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A1720 </td><td> Disolver en agua y filtrar esterilizar-(0,2-m filtro). Concentración Stock: 200 mg / ml. Almacenar a 4 ° C. </td></tr><tr><td> ClonNAT (nourseothricin) </td><td> WERNER agentes biológicos </td><td> 5001000 </td><td> Disolver en agua y filtrar esterilizar-(0,2-m filtro). Concentración Stock: 100 mg / ml. Almacenar a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Doxycycline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9891 </td><td> Disolver en etanol al 50% y esterilizar por filtración-(0,2-m filtro). Concentración de stock: 10 mg / ml. Hacer fresco cada cuatro semanas. Escudo de la luz con papel de aluminio y se almacena a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Zymolyase </td><td> ZymoResearch </td><td> E1005 </td><td></td></tr><tr><td> Levadura Difco base nitrogenada w / o aminoácidos </td><td> BD </td><td> 291940 </td><td></td></tr><tr><td> Revolver (rotor para tubos) </td><td> Labnet </td><td> H5600 </td><td></td></tr><tr><td> Enduro Gel XL unidad de electroforesis </td><td> Labnet </td><td> E0160 </td><td></td></tr><tr><td> Sonifier 450 </td><td> Branson </td><td> 101-063-198 </td><td></td></tr><tr><td> Microtip para Sonifier 450 </td><td> Branson </td><td> 101-148-062 </td><td></td></tr><tr><td> FACSAria clasificador de células </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MoFlo clasificador de células </td><td> Beckman-Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Biomek robot FX o equivalente </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td> Opcional. Para la creación de informes de terminación de genotipado. </td></tr></tbody> &lt;/ Table&gt;

the green monster process for the generation of yeast strains carrying multiple gene deletions

Fenotipos para un gen de supresión a menudo se revela sólo cuando la mutación se prueba en un fondo genético particular o 1,2 condición ambiental. Hay ejemplos en los que muchos genes deben ser eliminados para desenmascarar funciones ocultas genes 3,4. A pesar del potencial para descubrimientos importantes, las interacciones genéticas que involucran tres o más genes son en gran parte inexplorado. Búsquedas exhaustivas de múltiples interacciones mutantes sería poco práctico debido a la gran cantidad de posibles combinaciones de supresiones. Sin embargo, los estudios de conjuntos seleccionados de genes, como los juegos de paralogs con un mayor priori la posibilidad de compartir una función común, sería informativo. En la levadura Saccharomyces cerevisiae, gen knockout se logra mediante la sustitución de un gen con un marcador seleccionable mediante recombinación homóloga. Debido a que el número de marcadores es limitado, se han desarrollado métodos para retirar y volver a utilizar el sam<html> e 5,6,7,8,9,10 marcador. Sin embargo, las mutaciones de ingeniería secuencialmente múltiples utilizando estos métodos lleva mucho tiempo debido a que el tiempo requerido amplía de forma lineal con el número de deleciones que se genera. A continuación se describe el método de Monstruo Verde para rutinariamente la ingeniería de múltiples eliminaciones en la levadura 11. En este método, una proteína verde fluorescente (GFP) reportero integrado en deleciones se utiliza para las cepas de etiquetas cuantitativamente de acuerdo con el número de deleciones contenidas en cada cepa (Figura 1). Rondas repetidas de surtido de GFP-marcados deleciones a través de apareamiento de levadura y la meiosis junto con citometría de flujo de enriquecimiento de las cepas que llevan más de estas deleciones conducir a la acumulación de deleciones en las cepas (Figura 2). Realización de varios procesos en paralelo, con cada proceso de incorporar una o más supresiones por ronda, reduce el tiempo necesario para la construcción de la cepa. contenido &quot;&gt; El primer paso es preparar un solo haploides mutantes llamado &#39;ProMonsters&#39;, cada uno de los cuales lleva un reportero GFP en un locus eliminado y uno de los &#39;toolkit&#39; loci, ya sea GMToolkit-un monstruo verde o GMToolkit α-en el . can1Δ locus (Figura 3) utilizando cepas de la colección de supresión de levadura 12, GFP-marcadas deleciones pueden ser convenientemente generado mediante la sustitución de la casete KanMX4 común existente en estas cepas con una GFP universal - URA3 Cada fragmento contiene GMToolkit:. sea la a - o α-apareamiento de tipo específico del marcador de selección haploide 1 y exactamente uno de los dos marcadores que, cuando ambos están presentes GMToolkits, colectivamente permiten la selección de diploides. El segundo paso consiste en llevar a cabo el ciclo sexual a través del cual loci de deleción se pueden combinar en una sola célula por la variedad aleatoria y / o RECOMB meióticaminación que acompaña a cada ciclo de apareamiento y la esporulación.

Cuando una cepa haploide a-con cuatro supresiones marcadas GFP-(ycl033cΔ yer042wΔ ykl069wΔ yol118cΔ) se cruzó con una cepa haploide-α con cuatro supresiones (ycl033cΔ ydl242wΔ ydl227cΔ yer042wΔ), con dos deleciones (ycl033cΔ yer042wΔ) compartida por dos cepas, un representante resultado se obtuvo. La mezcla de apareamiento se cultivaron en medio YPDA contenía G418 y Nat para seleccionar los diploides. Los diploides resultantes se cultivaron en medio de esporulaci?...

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The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

El método monstruo verde permite el montaje rápido de deleciones múltiples marcados con un gen reportero que codifica la proteína verde fluorescente. Este método se basa en la conducción de las cepas de levadura a través de ciclos repetidos de surtido sexual de las deleciones y de enriquecimiento basado en la fluorescencia de las células que llevan más deleciones.

El Proceso de Monstruo Verde para la generación de cepas de levadura que llevan deleciones múltiples genes

Phenotypes  for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a  particular genetic background or environmental condition1,2. ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

La preparación de cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina por electroporación

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Investigación

Biología

Spinal Cord Electrophysiology

La médula espinal de Electrofisiología

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

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En la reconstitución in vitro de los activos T. castaneum telomerasa

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generación de ratones derivados de células madre pluripotentes inducidas

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genoma escala supresiones de genes en<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Por PCR de alto rendimiento

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Florecimiento extracción de proteínas de levadura y purificación para el Estudio de la función, las interacciones y modificaciones post-traduccionales

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

Nanogold Etiquetado del Sistema Endosomal Levadura de análisis ultraestructurales

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Aislar Potenciada Hsp104 Variantes Usando levadura Modelos proteinopatía

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

Generación de deleciones genómicas en líneas celulares de mamíferos a través de CRISPR / Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Aplicaciones de pHluorin para cuantitativa, cinética y de alto rendimiento Análisis de la endocitosis de levadura en ciernes

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...