Name: the green monster process for the generation of yeast strains carrying multiple gene deletions
Uploaded: 2012-12-15T15:03:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions at JoVE.com

Detta arbete stöddes av USA Defense Advanced Research Projects Agency kontrakt N66001-12-C-4039 till YS, ett anslag från Alfred P. Sloan Foundation till RSL och amerikanska National Institutes of Health bidrag R01 HG003224 och R21 CA130266 till FPRFPR var också stöds av en gemenskap från den kanadensiska institutet för avancerad forskning och genom Kanadas Excellence Research Stolar programmet.

1. Generering av ProMonsters <ol><li> Förbered den universella kassett GFP ersättning genom att förstärka en tetO 2-GFP markör och URA3 markören från plasmiden pYOGM012 (ampicillinresistens) användning av primrar med sekvenser: GGATCCCCGGGTTAATTAAGGCGCGCCAGATCTGTTTAGCTTGCC CAAGCTCCTCGAGTAATTCG och GGCGTTAGTATCGAATCGACAGCAGTATAGCGACCAGCATTCAC GTACCGGGTAATAACTGATATAAT (fetstil regioner ger homologi med de flankerande regionerna av KanMX4</...

<ol>
	<li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants.">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science's STKE. 294, 2364-23 (2001).</li><li>Hillenmeyer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+genomic+portrait+of+yeast:+uncovering+a+phenotype+for+all+genes.">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li><li>Beh, C. T., Cool, L., Phillips, J., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+functions+of+the+yeast+oxysterol-binding+protein+homologues.">Overlapping functions of the yeast oxysterol-binding protein homologues.</a> Genetics. 157, 1117 (2001).</li><li>Wieczorke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+knock-out+of+at+least+20+transporter+genes+is+required+to+block+uptake+of+hexoses+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Concurrent knock-out of at least 20 transporter genes is required to block uptake of hexoses in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS letters. 464, 123-128 (1999).</li><li>Alani, E., Cao, L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+gene+disruption+that+allows+repeated+use+of+URA3+selection+in+the+construction+of+multiply+disrupted+yeast+strains.">A method for gene disruption that allows repeated use of URA3 selection in the construction of multiply disrupted yeast strains.</a> Genetics. 116, 541-545 (1987).</li><li>Akada, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-mediated+seamless+gene+deletion+and+marker+recycling+in+Saccharomyces+cerevisiae.">PCR-mediated seamless gene deletion and marker recycling in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23, 399-405 (2006).</li><li>Guldener, U., Heck, S., Fielder, T., Beinhauer, J., Hegemann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+efficient+gene+disruption+cassette+for+repeated+use+in+budding+yeast.">A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast.</a> Nucleic acids research. 24, 2519 (1996).</li><li>Delneri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+redundancy+in+the+yeast+genome:+an+improved+strategy+for+use+of+the+cre-loxP+system.">Exploring redundancy in the yeast genome: an improved strategy for use of the cre-loxP system.</a> Gene. 252, 127-135 (2000).</li><li>Storici, F., Lewis, L. K., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+site-directed+mutagenesis+using+oligonucleotides.">In vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides.</a> Nat. Biotech. 19, 773-776 (2001).</li><li>Noskov, V. N., Segall-Shapiro, T. H., Chuang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+repeat+coupled+with+endonuclease+cleavage+(TREC):+a+seamless+modification+tool+for+genome+engineering+in+yeast.">Tandem repeat coupled with endonuclease cleavage (TREC): a seamless modification tool for genome engineering in yeast.</a> Nucl. Acids Res. 38, 2570-2576 (2010).</li><li>Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knocking+out+multigene+redundancies+via+cycles+of+sexual+assortment+and+fluorescence+selection.">Knocking out multigene redundancies via cycles of sexual assortment and fluorescence selection.</a> Nat. Methods. 8, 159-164 (2011).</li><li>Winzeler, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Characterization+of+the+S.+Genome+by+Gene+Deletion+and+Parallel+Analysis.">Functional Characterization of the S. Genome by Gene Deletion and Parallel Analysis.</a> Science. 285, 901-906 (1999).</li><li>Woods, R. A., Gietz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transformation+of+plasmid+DNA+into+yeast.">High-efficiency transformation of plasmid DNA into yeast.</a> Methods Mol. Biol. 177, 85-97 (2001).</li><li>Hughes, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+aneuploidy+revealed+by+DNA+microarray+expression+profiling.">Widespread aneuploidy revealed by DNA microarray expression profiling.</a> Nature. 25, 333-337 (2000).</li><li>Goldstein, A. L., McCusker, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+new+dominant+drug+resistance+cassettes+for+gene+disruption+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 15, 1541-1553 (1999).</li><li>Newman, J. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+proteomic+analysis+of+S.+cerevisiae+reveals+the+architecture+of+biological+noise.">Single-cell proteomic analysis of S. cerevisiae reveals the architecture of biological noise.</a> Nature. 441, 840-846 (2006).</li><li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+at+the+single-cell+level.">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307, 1962 (2005).</li></ol>

När vi utvecklade den gröna monster synsätt vi sysslar med möjlighet till rekombination mellan olika kassetter GFP ersättning, vilket leder till genomet omlagring. Mildra mot denna möjlighet är vårt urval av celler som framgångsrikt har genomgått flera omgångar av parning och meios. Celler som bär omlagrade genomen förväntas vara mindre passform efter parning till celler utan en identisk omlagring. Faktum, vi observerar någon genomet instabilitet till följd av rekombination mellan GFP kassetter 11.<...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn på reagens eller instrument </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (tillval) </td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A1720 </td><td> Lös i vatten och filtrera-sterilisera (0,2-im filter). Lager koncentration: 200 mg / ml. Förvaras vid 4 ° C. </td></tr><tr><td> ClonNAT (nourseothricin) </td><td> WERNER BioAgents </td><td> 5001000 </td><td> Lös i vatten och filtrera-sterilisera (0,2-im filter). Lager koncentration: 100 mg / ml. Förvaras vid 4 ° C. </td></tr><tr><td> Doxycyklin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9891 </td><td> Lös i 50% etanol och filtrera-sterilisera (0,2-im filter). Lager koncentration: 10 mg / ml. Göra färskt var fjärde vecka. Sköld från ljus med aluminiumfolie och förvara vid 4 ° C. </td></tr><tr><td> Zymolyas </td><td> ZymoResearch </td><td> E1005 </td><td></td></tr><tr><td> Difco jästkvävebas w / o aminosyror </td><td> BD </td><td> 291.940 </td><td></td></tr><tr><td> Revolver (rotator för rör) </td><td> Labnet </td><td> H5600 </td><td></td></tr><tr><td> Enduro Gel XL elektroforesenhet </td><td> Labnet </td><td> E0160 </td><td></td></tr><tr><td> Sonifier 450 </td><td> Branson </td><td> 101-063-198 </td><td></td></tr><tr><td> Mikrospets för Sonifier 450 </td><td> Branson </td><td> 101-148-062 </td><td></td></tr><tr><td> FACSAria cellsorterare </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MoFlo cellsorterare </td><td> Beckman-Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Biomek FX eller motsvarande robot </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td> Valfritt. För att ställa in genotypning PCR. </td></tr></tbody> &lt;/ Table&gt;

the green monster process for the generation of yeast strains carrying multiple gene deletions

Fenotyper för en gendeletion ofta avslöjas endast när mutationen testas i en viss genetisk bakgrund eller miljöförhållanden 1,2. Det finns exempel där många gener måste bort för att avslöja dolda genfunktioner 3,4. Trots risken för viktiga upptäckter, är genetiska interaktioner mellan tre eller flera gener i stort sett outforskat. Uttömmande sökningar i flera muterade interaktioner skulle vara opraktiskt på grund av det stora antalet möjliga kombinationer av strykningar. Skulle dock studier av utvalda uppsättningar av gener, som uppsättningar paraloger med större a priori chans att dela en gemensam funktion, vara informativ. I jästen Saccharomyces cerevisiae, är genen knockout åstadkoms genom att ersätta en gen med en selekterbar markör via homolog rekombination. Eftersom antalet markörer är begränsad, har metoder utvecklats för att avlägsna och återanvända sam<html> e markör 5,6,7,8,9,10. Emellertid är sekventiellt teknik multipla mutationer med användning av dessa metoder tidsödande, eftersom den tid som krävs skalor linjärt med antalet deletioner genereras. Här beskriver vi den gröna monster metoden för rutinmässigt konstruerar flera strykningar i jäst 11. I denna metod, är ett grönt fluorescerande protein (GFP) reporter integreras deletioner används för att kvantitativt märka stammar enligt antalet deletioner ingår i varje stam (Figur 1). Upprepade omgångar sortiment av GFP märkta-strykningar via jäst parning och meios tillsammans med flödes-cytometrisk anrikning av stammar som bär flera av dessa strykningar leder till ackumulering av deletioner i stammar (Figur 2). Utföra flera processer parallellt, med varje process innefattande en eller flera deletioner per runda, minskar tiden som krävs för stam konstruktion. innehåll &quot;&gt; Det första steget är att förbereda haploida singel-mutanter kallade&quot; ProMonsters, &quot;var och en bär en GFP reporter i en borttagen lokus och en av de&quot; verktygslåda &quot;loci, antingen gröna monster GMToolkit-a eller GMToolkit-α på . can1Δ lokus (figur 3) Använda stammar från jästen radering samlingen 12, kan GFP-märkta deletioner lämpligen genereras genom att ersätta den vanliga KanMX4 kassetten finns i dessa stammar med en universell GFP - URA3-fragmentet Varje GMToolkit innehåller:. antingen a - eller α-parning-typ-specifik haploida selektionsmarkör 1 och exakt en av de två markörerna som, när båda GMToolkits är närvarande, tillsammans medger selektion av diploider. Det andra steget är att utföra sexuella cykling genom vilken radering loci kan kombineras i en enda cell genom den slumpmässiga sorteringen och / eller meiotiska recombnering som medföljer varje cykel av parning och sporulering.

När en a-haploida stammen bär fyra GFP-märkta deletioner (ycl033cΔ yer042wΔ ykl069wΔ yol118cΔ) korsades med en α-haploida stammen bär fyra strykningar (ycl033cΔ ydl242wΔ ydl227cΔ yer042wΔ), med två strykningar (ycl033cΔ yer042wΔ) delas av två stammar, en företrädare resultat erhölls. Den passande blandningen odlades i YPDA medium innehållande G418 och Nat att välja diploider. De resulterande diploider odlades i sporbildningen mediet. Sporerna skingrades g...

Watch this Scientific Journal Video about The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions at JoVE.com

The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

Den gröna monster Metoden möjliggör snabb montering av flera deletioner markerade med en reportergen som kodar grönfluorescerande protein. Denna metod bygger på att köra jäststammar genom upprepade cykler av sexuell sortiment av strykningar och fluorescens-baserade anrikning av celler som bär fler strykningar.

Den gröna monster Process för generering av jäststammar Redovisat flera Gene Strykningar

Phenotypes  for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a  particular genetic background or environmental condition1,2. ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Beredningen av primära hematopoietisk cell kulturer från Murine Bone Marrow för elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Spinal Cord Electrophysiology

Ryggmärg Elektrofysiologi

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Beredning av Active T. castaneum Telomeras

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generering av möss härledda från inducerade pluripotenta stamceller

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletioner i<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Av High Throughput PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Spirande jästprotein extraktion och rening för studien av funktion, interaktioner, och post-translationella modifieringar

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

Nanoguld Märkning av jäst endosomal System för Ultra Analyser

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Isolera förstärkas Hsp104 Varianter Använda Jäst Proteinopathy modeller

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

Generation av genomiska Strykningar i däggdjurscellinjer via CRISPR / Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Tillämpningar av pHluorin för kvantitativ, kinetisk och hög kapacitet Analys av Endocytosis i knoppande jäst

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...