Name: analysis of single-cell gene transcription by rna fluorescent in situ hybridization (fish)
Uploaded: 2012-10-07T14:00:00
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Les auteurs tiennent à remercier Michael Alifrangis et Ulla Abildtrup pour le génotypage des parasites et Christina Holm pour l&#39;assistance technique excellente. Ce travail a été financé par Howard Hughes Medical Institute (subvention 55.005.511), la Fondation Lundbeck (subvention R9-A840) et par la Fondation Niels Bohr.

1. Génération de fraîchement sélectionnées érythrocytes infectés Pour ce test, les meilleurs résultats sont obtenus en utilisant des cultures fraîchement sélectionnés pour l&#39;expression en surface de la protéine PfEMP1. Dans cette expérience particulière du P. 3D7 lignée falciparum a été sélectionné en utilisant des anticorps spécifiques, comme décrit précédemment 1. Jour 1 <ol><li> Récolte 200 ul de cellules...

<ol>
	<li>Joergensen, L., Bengtsson, D. C., Bengtsson, A., Ronander, E., Berger, S. S., Turner, L., Dalgaard, M. B., Cham, G. K., Victor, M. E., Lavstsen, T., Theander, T. G., Arnot, D. E., Jensen, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+co-expression+of+two+different+PfEMP1+antigens+on+single+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+facilitates+binding+to+ICAM1+and+PECAM1.">Surface co-expression of two different PfEMP1 antigens on single Plasmodium falciparum-infected erythrocytes facilitates binding to ICAM1 and PECAM1.</a> PLoS Pathog. 2, 1001083 (2010).</li><li>Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+two+mRNA+species+at+single-cell+resolution+by+double-fluorescence+in+situ+hybridization.">Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization.</a> Nat. Protoc. 3, 1370-1379 (2008).</li><li>Cheeseborough, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> District Laboratory Practice in Tropical Countries. , (2006).</li><li>Brolin, K. J., Ribacke, U., Nilsson, S., Ankarklev, J., Moll, K., Wahlgren, M., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+transcription+of+duplicated+var2csa+gene+copies+in+individual+Plasmodium+falciparum+parasites.">Simultaneous transcription of duplicated var2csa gene copies in individual Plasmodium falciparum parasites.</a> Genome Biol. 10, R117 (2009).</li><li>Epp, C., Li, F., Howitt, C. A., Chookajorn, T., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+associated+sense+and+antisense+noncoding+RNAs+are+transcribed+from+the+var+gene+family+of+virulence+genes+of+the+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum.">Chromatin associated sense and antisense noncoding RNAs are transcribed from the var gene family of virulence genes of the malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> RNA. 15, 116-127 (2009).</li><li>Freitas-Junior, L. H., Hernandez-Rivas, R., Ralph, S. A., Montiel-Condado, D., Ruvalcaba-Salazar, O. K., Rojas-Meza, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+heterochromatin+propagation+and+histone+acetylation+control+mutually+exclusive+expression+of+antigenic+variation+genes+in+malaria+parasites.">Telomeric heterochromatin propagation and histone acetylation control mutually exclusive expression of antigenic variation genes in malaria parasites.</a> Cell. 121, 25-36 (2005).</li><li>Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locked+nucleic+acid-based+in+situ+detection+of+microRNAs+in+mouse+tissue+sections.">Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections.</a> Nature Protoc. 2, 1508-1514 (2007).</li><li>Li, F., Sonbuchner, L., Kyes, S. A., Epp, C., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+non-coding+RNA+are+transcribed+from+the+centromeres+of+Plasmodium+falciparum+and+are+associated+with+centromeric+chromatin.">Nuclear non-coding RNA are transcribed from the centromeres of Plasmodium falciparum and are associated with centromeric chromatin.</a> J. Biol. Chem. 283, 5692-5698 (2008).</li><li>Thompson, J., Sinden, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+Pbs21+mRNA+during+sexual+development+of+Plasmodium+berghei.">In situ detection of Pbs21 mRNA during sexual development of Plasmodium berghei.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 68, 189-196 (1994).</li><li>Thompson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+RNA+in+blood-+and+mosquito-stage+malaria+parasites.">In situ detection of RNA in blood- and mosquito-stage malaria parasites.</a> Methods Mole Med. 72, 225-235 (2002).</li><li>Arnot, D. E., Ronander, E., Bengtsson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progression+of+the+intra-erythrocytic+cell+cycle+of+Plasmodium+falciparum+and+the+role+of+the+centriolar+plaques+in+asynchronous+mitotic+division+during+schizogony.">The progression of the intra-erythrocytic cell cycle of Plasmodium falciparum and the role of the centriolar plaques in asynchronous mitotic division during schizogony.</a> Int. J. Parasitol. 41, 71-80 (2011).</li><li>Osborne, C. S., Chakalova, L., Brown, K. E., Carter, D., Horton, A., Debrand, E., Goyenechea, B., Mitchell, J. A., Lopes, S., Reik, W., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+genes+dynamically+colocalize+to+shared+sites+of+ongoing+transcription.">Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription.</a> Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).</li></ol>

Analyse FISH ARN, contrairement aux méthodes telles que Northern blot et RT-PCR, permet la discrimination des transcrits d&#39;ARNm spécifiques au niveau de la cellule unique. Cela permet de faire la distinction entre les cellules transcriptionnellement actifs et inactifs, dans cet exemple, P. falciparum protozoaires parasites à l&#39;intérieur des globules rouges humains. Ces cellules entières observations sont souvent nécessaires et peuvent percer importantes et nouvelles tendances de la transcription <...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Acide acétique </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> 338 826-100ml </td><td></td></tr><tr><td> Albumax médias: solution de RPMI Glutamine 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 ml de RPMI 1640 Une solution à 5 ml de glutamine </td></tr><tr><td> Albumax médias: Gentamicine sulfate Albumax solution </td><td> Lonza </td><td> BE02-012E </td><td> 2,5 ml de gentamycine sulfate 50 ml de solution Albumax </td></tr><tr><td> Albumax solution: Hypoxanthine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9377 </td><td> 0,8 g Hypoxanthine </td></tr><tr><td> Albumax solution: AlbuMAX II </td><td> Jenvitrogen </td><td> 11021-037 </td><td> 200 g Albumax </td></tr><tr><td> Albumax solution: RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 4 litres du milieu RPMI 1640 Dissoudre avec aimant au max. 50 ° C. Filtrez stériliser et conserver à -20 ° C en aliquots. </td></tr><tr><td> Amberlite </td><td> Sigma </td><td> A5710-110G </td><td> Résine de deionize formamide. </td></tr><tr><td> Anti-biotine conjugué à la peroxydase de chèvre pAb </td><td> Calbiochem </td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorps anti-DIG </td><td> Novus biologiques </td><td> NB100-41330 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-fade réactif avec DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td> Les milieux de montage doit durcir pendant 24 heures avant de sceller complètement la diapositive. </td></tr><tr><td> Biotine ARN étiquetage Mix </td><td&gt; Roche </td><td> 11685597910 </td><td></td></tr><tr><td> Appareil photo numérique </td><td> Numérique Nikon F11 de vue CC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lamelles de </td><td> Menzel-Glaser </td><td> 631-1570 </td><td></td></tr><tr><td> flacon de culture de 25 cm 2 de surface Nunclon </td><td> Nunc </td><td> 156340 </td><td></td></tr><tr><td> DEPC </td><td> Fluka / Sigma </td><td> 32490-100ml </td><td> 1 ml DEPC dans 1000 ml d&#39;eau deinonized. Ajouter un barreau aimanté et remuer pendant 12 h. Autoclave pendant 30 min. </td></tr><tr><td> Appareil photo numérique </td><td> Numérique Nikon F11 de vue CC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Protéines Dynabeads A </td><td> Invitrogen </td><td> 10002D </td><td></td></tr><tr><td> DynaMaq-15 Aimant </td><td> Invitrogen </td><td> 123-01D </td><td></td></tr><tr><td> Formamide bioultra 99% </td><td> Fluka/ Sigma </td><td> 47671-1l-F </td><td> Formamide désionisée: 5 g de résine échangeuse d&#39;ions par 100 ml de formamide. Mélanger 30 min. Filtrer sur papier Whatman. </td></tr><tr><td> . Gélatine 0 solution à 75%: gélatine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2500 </td><td> 3,75 gélatine g dans 500 ml de RPMI 1640. La chaleur à 56 ° C pour dissoudre. Stériliser par filtration alors que 56 ° C. Conserver à -20 ° C en aliquots. </td></tr><tr><td> . Gélatine 0 solution à 75%: RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 3,75 gélatine g dans 500 ml de RPMI 1640. La chaleur à 56 ° C pour dissoudre. Stériliser par filtration alors que 56 ° C. Conserver à -20 ° C en aliquots. </td></tr><tr><td> Solution Glutamine: L-glutamine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G3126 </td><td> 14,6 g L-glutamine dans 500 ml de NaCl 0,9%. Dissoudre, filtre sterilize et stocker à -20 ° C en aliquots. </td></tr><tr><td> Solution Glutamine: HCl </td><td> Sigma </td><td> H1758 </td><td> 14,6 g L-glutamine dans 500 ml de NaCl 0,9%. Dissoudre, filtrer stériliser et conserver à -20 ° C en aliquots. </td></tr><tr><td> Solution d&#39;hybridation: formamide Bio ultra 99% SSC 20x </td><td> Fluka / Sigma </td><td> 47671-1l-F </td><td> Total 20 ml, garder congelé à -20 ° C en aliquots 10 ml de formamide désionisée </td></tr><tr><td> Solution d&#39;hybridation: Concentré 50x Denhardt </td><td> Sigma </td><td> D2532 </td><td> 5ml 20xSSC </td></tr><tr><td> Solution d&#39;hybridation: Levure tRNARoche blocage réactif </td><td> Sigma </td><td> R-6750 </td><td> 2 ml 50x Denhardt 250 ul de 20 mg par ml de levure ARNt </td></tr><tr><td><td> Fluka / Sigma </td><td> 31149-106GF </td><td> 0.4g Roche réactif de blocage 1 ml de 10 mg par ml d&#39;ADN de sperme de saumon (Critique: saumon dénaturent spermDNA à 96 ° C pendant 5 min avant d&#39;ajouter à la solution d&#39;hybridation) </td></tr><tr><td> Hybridizer ThermoStar 100 HC4 </td><td> Quantifoil Instruments GmbH </td><td> 1004-0011 </td><td> Peut être remplacé par un four d&#39;hybridation et d&#39;hybridation RNase chambres libres rembourrés avec de l&#39;eau DEPC. </td></tr><tr><td> Immersion huile transparente aux UV fluorescence gratuit </td><td> Sigma </td><td> 10976-1EA </td><td></td></tr><tr><td> Microscope confocal immunofluorescence ou </td><td> Nikon D-Eclipse TE2000C </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vernis à ongles </td><td> Disponible dans n&#39;importe quelle pharmacie </td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBS 20x: NaCl KCl Na 2 HPO 4 x 2H 2 O KH 2 PO 4 DEPC désionisée H 2 O </td><td></td><td></td><td> Ajuster le pH à 7,4 160 g 4 g 23 g 4 g 1 l </td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde à 4% </td><td> Fluka / Chemika </td><td> 76240 </td><td> 4 g PFA dans 80 ml de PBS / DEPC. La chaleur à 65 ° C jusqu&#39;à ce que le PFA dissout. Ajouter 20 ml de PBS, laisser la solution refroidir. Ajuster le pH à 7,4. Filtrer. Boutique en aliquotes à -20 ° C. </td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde à 4% / acide acétique à 5% </td><td></td><td></td><td> 950 paraformaldhyde ul + 50 ul d&#39;acide acétique </td></tr><tr><td> Pepsine </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> P7000 </td><td></td></tr><tr><td> Conjugué à la peroxydase anti-biotine </td><td> Calbiochem </td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td> RBC-milieu de lavage: solution de RPMI Glutamine 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 ml de RPMI 1640 une solution à 5 ml de glutamine </td></tr><tr><td> RBC-milieu de lavage: le sulfate de gentamicine </td><td> Lonza </td><td> BE02-012E </td><td> 2,5 ml de gentamycine sulfate </td></tr><tr><td> RNase </td><td> Sigma / Aldrich </td><td></td><td> Faire un 10 mg / ml de solution. </td></tr><tr><td> RNase tube de 1,5 ml </td><td> Ambion </td><td> AM12450 </td><td></td></tr><tr><td> RNase Zap </td><td> Ambion </td><td> AM9780 </td><td></td></tr><tr><td> Diapositives 11mm 4 puits </td><td> Thermo Scientific </td><td> MENZXER306W </td><td></td></tr><tr><td> SSC 20x: NaCl </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> S9625 </td><td> 3 M de NaCl (175 g / l) 0,3 M citrate de Na 3 x H 2 O (88 g / l) Ajuster à pH 7,0 avec HCl 1M </td></tr><tr><td> SSC 20x: citrate de sodium dihydraté </td><td> Sigma / aldrich </td><td> W302600 </td><td> 3 M de NaCl (175 g / l) 0,3 M citrate de Na 3 x H 2 O (88 g / l) Ajuster à pH 7,0 avec HCl 1M </td></tr><tr><td> PESS 20x: NaCl </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> S9625 </td><td> 175,3 g de NaCl </td></tr><tr><td> PESS 20x: NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> S0751 </td><td> 27,6 g de NaH 2 PO 4. </td></tr><tr><td> PESS 20x: 4 EDTA en poudre </td><td></td><td></td><td> 9,4 g d&#39;EDTA en poudre Ajouter de l&#39;eau DEPC, ajuster le pH 7,4. Autofendit pendant 20 min </td></tr><tr><td> TNB mémoire tampon: tampon TNT </td><td></td><td></td><td> 10 ml du tampon TNT </td></tr><tr><td> TNB mémoire tampon: réactif de blocage </td><td></td><td></td><td> 0,05 g de réactif de blocage Pour dissoudre le réactif de blocage, chauffer la solution à 60 ° C pendant une heure sous agitation. Conserver à -20 ° C. (Dérivé de l&#39;Perkin Elmer TSA-protocole). </td></tr><tr><td> TNT mémoire tampon: Tris / HCl </td><td> Sigma </td><td> T1503 </td><td> 1M Tris / HCl, pH 8,0 </td></tr><tr><td> TNT mémoire tampon: NaCl </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S9625 </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> Tampon TNT: Tween20 </td><td> Sigma </td><td> 93773 </td><td> 5 M NaCl 30 ml 1 ml DEPC dH 2 O869 Ml Ajuster le pH à 7,5 à la température ambiante. (Dérivé de l&#39;Perkin Elmer TSA-protocole). </td></tr><tr><td> TSA, plus Cyanine3 / fluorescéine système </td><td> Perkin Elmer </td><td> NEL753000IKT </td><td> Lire le protocole de la TSA Plus System Palette de fluorescence avec soin avant de commencer l&#39;expérience. </td></tr><tr><td> Tubes 14 ml stérile </td><td> Almeco - CM Aps LAB </td><td> 91016 </td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of single-cell gene transcription by rna fluorescent in situ hybridization (fish)

L&#39;adhérence des érythrocytes infectés par Plasmodium falciparum (IE) à l&#39;homme récepteurs endothéliaux au cours des infections de paludisme est médiée par l&#39;expression de PfEMP1 variantes de protéines codées par les gènes var. Le P. haploïde falciparum génome abrite environ 60 différents gènes var dont une seule a été soupçonnés d&#39;être transcrit par cellule à la fois pendant la phase de l&#39;infection du sang. Comment une telle réglementation mutuellement exclusif de la transcription des gènes var est atteint n&#39;est pas claire, ainsi que l&#39;identification des différents gènes var ou sous-groupes de gènes var associés aux différents récepteurs et les conséquences de la liaison différentielle sur les résultats cliniques de P. infections à P. falciparum. Récemment, le paradigme de la transcription mutuellement exclusive a été mise en doute par des essais de transcription individuelle sur la base de P. identification transcription falciparum chez inf uniqueète cellules érythrocytaires en utilisant l&#39;ARN d&#39;hybridation fluorescente in situ (FISH) de la transcription des gènes var par le parasite dans différents noyaux de P. falciparum IE 1. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour la réalisation de la méthodologie ARN-FISH pour l&#39;analyse de la transcription des gènes var dans un seul noyau de P. falciparum infection des érythrocytes humains. La méthode est basée sur l&#39;utilisation de la digoxigénine marqué à la biotine et des sondes d&#39;ARN antisens en utilisant la TSA plus Fluorescence Palette Système 2 (Perkin Elmer), des analyses microscopiques et fraîchement sélectionné P. falciparum IE. Dans le procédé d&#39;hybridation in situ peut être utilisé pour contrôler la transcription et la régulation d&#39;une variété de gènes exprimés au cours des différentes étapes du P. cycle de vie falciparum et est adaptable à d&#39;autres espèces de parasites du paludisme et d&#39;autres organismes et des types cellulaires.

La figure 1 illustre un organigramme des principales étapes et pendant la durée de la méthodologie FISH ARN. Une série d&#39;images représentatives de bien et mal conservés tachées expériences FISH ARNm en utilisant unique P. falciparum IE sont présentés dans la figure 2. Ce protozoaire intracellulaire a une petite (1-1.5 um de diamètre) dans le noyau qui est coloré en bleu au DAPI. Vingt-quatre heures après l&#39;invasion érythrocytai...

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Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent<em&gt; In situ</emHybridation&gt; (FISH) pour identifier des transcrits d&#39;ARNm dans des cellules individuelles permet l&#39;analyse de l&#39;activité polygénique tel que la transcription simultanée de plus d&#39;un membre de la<em&gt; Var</emFamille multigénique&gt; dans<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Érythrocytes infectés<sup&gt; 1</sup&gt;. La technique est adaptable et peut être utilisé sur différents types de gènes, des cellules et des organismes.

Analyse de la transcription génique unique cellule par l&#39;ARN fluorescent<em&gt; In Situ</emHybridation&gt; (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

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