Name: analysis of single-cell gene transcription by rna fluorescent in situ hybridization (fish)
Uploaded: 2012-10-07T14:00:00
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Die Autoren bedanken sich bei Michael Alifrangis und Ulla Abildtrup zur Genotypisierung von Parasiten und Christina Holm für hervorragende technische Unterstützung danken. Diese Arbeit wurde vom Howard Hughes Medical Institute (Zuschuss 55.005.511), The Lundbeck Foundation (R9-A840) und durch die Niels Bohr Foundation finanziert.

Ein. Generation von Frisch gewählte infizierten Erythrozyten Für diesen Test werden die besten Ergebnisse erhalten werden, wenn unter Verwendung von frisch ausgewählt Kulturen für Oberflächenexpression von PfEMP1 Protein. In diesem speziellen Experiment das 3D7 P. falciparum Linie gewählt wurde mittels spezifischer Antikörper wie zuvor 1 beschrieben. Tag 1 <ol><li> Ernte 200 ul verpackt Blutzellen aus einer P. falciparum Kultur ...

<ol>
	<li>Joergensen, L., Bengtsson, D. C., Bengtsson, A., Ronander, E., Berger, S. S., Turner, L., Dalgaard, M. B., Cham, G. K., Victor, M. E., Lavstsen, T., Theander, T. G., Arnot, D. E., Jensen, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+co-expression+of+two+different+PfEMP1+antigens+on+single+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+facilitates+binding+to+ICAM1+and+PECAM1.">Surface co-expression of two different PfEMP1 antigens on single Plasmodium falciparum-infected erythrocytes facilitates binding to ICAM1 and PECAM1.</a> PLoS Pathog. 2, 1001083 (2010).</li><li>Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+two+mRNA+species+at+single-cell+resolution+by+double-fluorescence+in+situ+hybridization.">Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization.</a> Nat. Protoc. 3, 1370-1379 (2008).</li><li>Cheeseborough, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> District Laboratory Practice in Tropical Countries. , (2006).</li><li>Brolin, K. J., Ribacke, U., Nilsson, S., Ankarklev, J., Moll, K., Wahlgren, M., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+transcription+of+duplicated+var2csa+gene+copies+in+individual+Plasmodium+falciparum+parasites.">Simultaneous transcription of duplicated var2csa gene copies in individual Plasmodium falciparum parasites.</a> Genome Biol. 10, R117 (2009).</li><li>Epp, C., Li, F., Howitt, C. A., Chookajorn, T., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+associated+sense+and+antisense+noncoding+RNAs+are+transcribed+from+the+var+gene+family+of+virulence+genes+of+the+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum.">Chromatin associated sense and antisense noncoding RNAs are transcribed from the var gene family of virulence genes of the malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> RNA. 15, 116-127 (2009).</li><li>Freitas-Junior, L. H., Hernandez-Rivas, R., Ralph, S. A., Montiel-Condado, D., Ruvalcaba-Salazar, O. K., Rojas-Meza, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+heterochromatin+propagation+and+histone+acetylation+control+mutually+exclusive+expression+of+antigenic+variation+genes+in+malaria+parasites.">Telomeric heterochromatin propagation and histone acetylation control mutually exclusive expression of antigenic variation genes in malaria parasites.</a> Cell. 121, 25-36 (2005).</li><li>Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locked+nucleic+acid-based+in+situ+detection+of+microRNAs+in+mouse+tissue+sections.">Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections.</a> Nature Protoc. 2, 1508-1514 (2007).</li><li>Li, F., Sonbuchner, L., Kyes, S. A., Epp, C., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+non-coding+RNA+are+transcribed+from+the+centromeres+of+Plasmodium+falciparum+and+are+associated+with+centromeric+chromatin.">Nuclear non-coding RNA are transcribed from the centromeres of Plasmodium falciparum and are associated with centromeric chromatin.</a> J. Biol. Chem. 283, 5692-5698 (2008).</li><li>Thompson, J., Sinden, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+Pbs21+mRNA+during+sexual+development+of+Plasmodium+berghei.">In situ detection of Pbs21 mRNA during sexual development of Plasmodium berghei.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 68, 189-196 (1994).</li><li>Thompson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+RNA+in+blood-+and+mosquito-stage+malaria+parasites.">In situ detection of RNA in blood- and mosquito-stage malaria parasites.</a> Methods Mole Med. 72, 225-235 (2002).</li><li>Arnot, D. E., Ronander, E., Bengtsson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progression+of+the+intra-erythrocytic+cell+cycle+of+Plasmodium+falciparum+and+the+role+of+the+centriolar+plaques+in+asynchronous+mitotic+division+during+schizogony.">The progression of the intra-erythrocytic cell cycle of Plasmodium falciparum and the role of the centriolar plaques in asynchronous mitotic division during schizogony.</a> Int. J. Parasitol. 41, 71-80 (2011).</li><li>Osborne, C. S., Chakalova, L., Brown, K. E., Carter, D., Horton, A., Debrand, E., Goyenechea, B., Mitchell, J. A., Lopes, S., Reik, W., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+genes+dynamically+colocalize+to+shared+sites+of+ongoing+transcription.">Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription.</a> Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).</li></ol>

FISH-Analyse RNA im Gegensatz zu Verfahren, wie Northern Blot und RT-PCR, erlaubt die Diskriminierung von spezifischen mRNA-Transkripte in der einzelnen Zelle. Dies macht es möglich, zwischen transkriptionell aktiven und inaktiven Zellen zu unterscheiden, in diesem Beispiel, P. parasitischen Protozoen falciparum in menschlichen roten Blutzellen. Solche whole-cell Beobachtungen sind oft notwendig und kann zu entwirren wichtige und neuartige transkriptionellen Mustern ein. <p class="jove_...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Essigsäure </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> 338.826-100ml </td><td></td></tr><tr><td> Albumax Medien: RPMI 1640 Glutamin-Lösung </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 ml RPMI 1640 5 ml Glutamin-Lösung </td></tr><tr><td> Albumax Medien: Gentamycinsulfat Albumax-Lösung </td><td> Lonza </td><td> BE02-012E </td><td> 2,5 ml Gentamicinsulfat 50 ml Albumax-Lösung </td></tr><tr><td> Albumax-Lösung: Hypoxanthine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9377 </td><td> 0,8 g Hypoxanthine </td></tr><tr><td> Albumax-Lösung: AlbuMAX II </td><td> Ichnvitrogen </td><td> 11021-037 </td><td> 200 g Albumax </td></tr><tr><td> Albumax-Lösung: RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 4 Liter RPMI 1640 Auflösen mit Magneten an max. 50 ° C. Filtern sterilisieren und bei -20 ° C in Aliquots. </td></tr><tr><td> Amberlite </td><td> Sigma </td><td> A5710-110G </td><td> Resin zu Formamid entionisieren. </td></tr><tr><td> Anti-Biotin Ziege pAb Peroxidase Konjugat </td><td> Calbiochem </td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Dig-Antikörper </td><td> Novus Biologicals </td><td> NB100-41330 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Fade Reagenz mit DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td> Die Montage media hat für 24 h vor dem Versiegeln die Folie vollständig zu heilen. </td></tr><tr><td> Biotin RNA Labeling Mix </td><td&gt; Roche </td><td> 11685597910 </td><td></td></tr><tr><td> Kamera digital </td><td> Nikon digitale Anblick DC-F11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deckgläser </td><td> Menzel-glaser </td><td> 631-1570 </td><td></td></tr><tr><td> Kulturflasche 25 cm 2 Nunclon Oberfläche </td><td> Nunc </td><td> 156340 </td><td></td></tr><tr><td> DEPC </td><td> Fluka / Sigma </td><td> 32.490-100ml </td><td> 1 ml DEPC in 1000 ml deinonized Wasser. Schreibe einen Rührstab und rühren für 12 Stunden. Autoklaven für 30 min. </td></tr><tr><td> Digitalkamera </td><td> Nikon digitale Anblick DC-F11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads Protein A </td><td> Invitrogen </td><td> 10002D </td><td></td></tr><tr><td> DynaMaq-15 Magnet </td><td> Invitrogen </td><td> 123-01D </td><td></td></tr><tr><td> Formamid bioultra 99% </td><td> Fluka/ Sigma </td><td> 47.671-1l-F </td><td> Deionisiertes Formamid: 5 g Ionenaustauscherharz pro 100 ml Formamid. Stir 30 min. Anschließend wird durch Whatman-Papier. </td></tr><tr><td> . Gelatine 0 75% ige Lösung: Gelatine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2500 </td><td> 3,75 g Gelatine in 500 ml RPMI 1640. Wärme auf 56 ° C zu lösen. Filtern sterilisieren, wenn 56 ° C. Lagerung bei -20 ° C in Aliquots. </td></tr><tr><td> . Gelatine 0 75% ige Lösung: RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 3,75 g Gelatine in 500 ml RPMI 1640. Wärme auf 56 ° C zu lösen. Filtern sterilisieren, wenn 56 ° C. Lagerung bei -20 ° C in Aliquots. </td></tr><tr><td> Glutamin-Lösung: L-Glutamin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G3126 </td><td> 14,6 g L Glutamin in 500 ml 0,9% NaCl. Auflösen, Filter sterilize und bei -20 ° C in Aliquots. </td></tr><tr><td> Glutamin-Lösung: HCl </td><td> Sigma </td><td> H1758 </td><td> 14,6 g L Glutamin in 500 ml 0,9% NaCl. Auflösen, filtern sterilisieren und bei -20 ° C in Aliquots. </td></tr><tr><td> Hybridisierungslösung: Formamid Bio Ultra 99% SSC 20x </td><td> Fluka / Sigma </td><td> 47.671-1l-F </td><td> Insgesamt 20 ml, halten gefroren bei -20 ° C in Aliquots 10 ml entionisiertem Formamid </td></tr><tr><td> Hybridisierungslösung: Denhardts 50x Konzentrat </td><td> Sigma </td><td> D2532 </td><td> 5ml 20 × SSC </td></tr><tr><td> Hybridisierungslösung: Hefe tRNARoche Blockierungsreagenz </td><td> Sigma </td><td> R-6750 </td><td> 2 ml 50x Denhardt 250 ul 20 mg pro ml Hefe tRNA </td></tr><tr><td><sTrong&gt; Hybridisierungslösung: Lachs-Sperma-DNA </td><td> Fluka / Sigma </td><td> 31.149-106GF </td><td> 0.4g Roche Blockierungsreagenz 1 ml von 10 mg pro ml Lachssperma-DNA (Critical: denaturieren Lachs spermDNA bei 96 ° C für 5 min vor Zugabe zu der Hybridisierungslösung) </td></tr><tr><td> Hybridizer ThermoStar 100 HC4 </td><td> Quantifoil Instruments GmbH </td><td> 1004-0011 </td><td> Kann durch Hybridisierung Backofen und RNase-frei Hybridisierung Kammern mit DEPC-Wasser aufgefüllt ersetzt werden. </td></tr><tr><td> Immersionsöl UV transparent fluoreszenzfrei </td><td> Sigma </td><td> 10.976-1EA </td><td></td></tr><tr><td> Immunfluoreszenz oder Konfokalmikroskop </td><td> Nikon D-Eclipse TE2000C </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nagellack </td><td> Erhältlich in der Apotheke </td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBS 20x: NaCl KCl Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O KH 2 PO 4 DEPC deionisiertem H 2 O </td><td></td><td></td><td> Ajust pH auf 7,4 160 g 4 g 23 g 4 g 1 l </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd 4% </td><td> Fluka / Chemika </td><td> 76240 </td><td> 4 g PFA in 80 ml PBS / DEPC. Wärme auf 65 ° C, bis die PFA auflöst. 20 ml PBS, dass die Lösung abkühlen. Den pH-Wert auf 7,4. Filtern. Store in Aliquots bei -20 ° C. </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd 4% / Acid Essigsäure 5% </td><td></td><td></td><td> 950 ul Paraformaldehyd + 50 ul Essigsäure </td></tr><tr><td> Pepsin </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> P7000 </td><td></td></tr><tr><td> Peroxidase-konjugiertes anti-Biotin </td><td> Calbiochem </td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td> RBC-wash Medien: RPMI 1640 Glutamin-Lösung </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 ml RPMI 1640-Lösung 5 ml Glutamin </td></tr><tr><td> RBC-wash Medien: Gentamycin-Sulfat </td><td> Lonza </td><td> BE02-012E </td><td> 2,5 ml Gentamicinsulfat </td></tr><tr><td> RNase </td><td> Sigma / Aldrich </td><td></td><td> Machen Sie eine 10 mg / ml Stammlösung. </td></tr><tr><td> RNase freies 1,5 ml Tube </td><td> Ambion </td><td> AM12450 </td><td></td></tr><tr><td> RNase Zap </td><td> Ambion </td><td> AM9780 </td><td></td></tr><tr><td> Gleitet 4 Vertiefungen 11mm </td><td> Thermo Scientific </td><td> MENZXER306W </td><td></td></tr><tr><td> SSC 20x: NaCl </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> S9625 </td><td> 3 M NaCl (175 g / l) 0,3 M Na 3-Citrat x H 2 O (88 g / l) auf pH 7,0 einstellen mit 1M HCl </td></tr><tr><td> SSC 20x: Natriumcitrat Dihydrat </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> W302600 </td><td> 3 M NaCl (175 g / l) 0,3 M Na 3-Citrat x H 2 O (88 g / l) auf pH 7,0 einstellen mit 1M HCl </td></tr><tr><td> SSPE 20x: NaCl </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> S9625 </td><td> 175,3 g NaCl </td></tr><tr><td> SSPE 20x: NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> S0751 </td><td> 27,6 g NaH 2 PO 4. </td></tr><tr><td> SSPE 20x: 4 EDTA-Pulver </td><td></td><td></td><td> 9,4 g EDTA-Pulver Fügen DEPC Wasser, pH-Einstellung 7,4. Autospaltete für 20 min </td></tr><tr><td> TNB-Puffer: TNT-Puffer </td><td></td><td></td><td> 10 ml TNT-Puffer </td></tr><tr><td> TNB-Puffer: Blockierungsreagenz </td><td></td><td></td><td> 0.05g Blockierungsreagenz Um das Blockierungsreagenz aufzulösen, erhitzen der Lösung auf 60 ° C für eine Stunde unter Rühren. Lagerung bei -20 ° C. (Abgeleitet von der Firma Perkin Elmer TSA-Protokoll.) </td></tr><tr><td> TNT-Puffer: Tris / HCl </td><td> Sigma </td><td> T1503 </td><td> 1 M Tris / HCl, pH 8,0 </td></tr><tr><td> TNT-Puffer: NaCl </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S9625 </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> TNT Puffer: Tween20 </td><td> Sigma </td><td> 93773 </td><td> 5 M NaCl 30 ml 1 ml DEPC dH 2 O869 Ml PH-Wert auf 7,5 bei Raumtemperatur. (Abgeleitet von der Firma Perkin Elmer TSA-Protokoll.) </td></tr><tr><td> TSA sowie Cyanine3 / Fluorescein-System </td><td> Perkin Elmer </td><td> NEL753000IKT </td><td> Lesen Sie das Protokoll aus der TSA Plus-Fluoreszenz Palette Systems sorgfältig durch, bevor das Experiment. </td></tr><tr><td> Tubes 14 ml sterile </td><td> Almeco - CM LAB Aps </td><td> 91016 </td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of single-cell gene transcription by rna fluorescent in situ hybridization (fish)

Adhäsion von Plasmodium falciparum infizierten Erythrozyten (IE) für die menschliche endotheliale Rezeptoren bei Malaria-Infektionen durch Expression PfEMP1 Protein-Varianten durch die Gene kodiert var vermittelt. Die haploiden P. falciparum Genoms beherbergt etwa 60 verschiedene Gene var von denen nur eine geglaubt hat, die pro Zelle zu einem Zeitpunkt während des Blut Stadium der Infektion transkribiert. Wie solche gegenseitig ausschließenden Regulierung der Gentranskription var erreicht ist unklar, da die Identifizierung einzelner Gene oder var Untergruppen von var Gene mit verschiedenen Rezeptoren und die Folge der unterschiedlichen Bindung auf das klinische Ergebnis von P. zugeordneten falciparum-Infektionen. Vor kurzem hat die gegenseitig ausschließende Transkription Paradigma in Zweifel durch Transkription Assays auf Basis einzelner P. aufgerufen falciparum transcript Identifikation in einzelnen infektiert erythrozytären Zellen unter Verwendung von RNA Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) von var Gentranskription durch den Parasiten im einzelnen Kerne von P. falciparum IE 1. Wir beschreiben hier ein ausführliches Protokoll zur Durchführung des RNA-FISH-Methodik zur Analyse von var Gentranskription in Einzel-Kerne von P. falciparum infiziert menschliche Erythrozyten. Das Verfahren beruht auf der Verwendung von Digoxigenin-Basis und Biotin-markierte Antisense-RNA-Sonden unter Verwendung der Fluoreszenz-Plus-TSA Palette System 2 (Perkin Elmer), mikroskopische Analysen und frisch ausgewählt P. falciparum IE. Die in situ-Hybridisierungsverfahren verwendet werden, um Transkription und Regulation einer Vielzahl von Genen in den verschiedenen Phasen des P. ausgedrückt überwachen falciparum Lebenszyklus und ist anpassungsfähig an andere Malaria-Parasiten Arten und anderen Organismen und Zelltypen.

Abbildung 1 zeigt ein Flussdiagramm der wichtigsten Schritte und der Zeitdauer der RNA FISH Methodik. Eine Reihe von repräsentativen Bildern von gut und schlecht erhaltenen gefärbten mRNA FISH-Experimente mit einzelnen P. falciparum IE sind in Abbildung 2 gezeigt. Diese intrazellulären Protozoen hat einen kleinen (1-1.5 Mikrometer Durchmesser) Kern, blau gefärbt mit DAPI wird. Vierundzwanzig Stunden nach Erythrozyten Invasion im P. falciparu...

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Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluoreszierend<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung (FISH) auf mRNA-Transkripte in den einzelnen Zellen zu identifizieren ermöglicht die Analyse von polygenen Tätigkeit wie die gleichzeitige Transkription von mehr als einem Mitglied der<em&gt; Var</em&gt; Multigenfamilie in<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Infizierten Erythrozyten<sup&gt; 1</sup&gt;. Die Technik ist anpassbar und kann bei verschiedenen Arten von Genen, Zellen und Organismen verwendet werden.

Analyse von Einzel-Zell-Gene Transkription durch RNA-Fluorescent<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

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In vitro Transkription und Capping von Gaussia-Luciferase mRNA von HeLa-Zelle Transfektion Gefolgt

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