Name: analysis of single-cell gene transcription by rna fluorescent in situ hybridization (fish)
Uploaded: 2012-10-07T14:00:00
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Gli autori desiderano ringraziare Michael Alifrangis e Ulla Abildtrup per la genotipizzazione di parassiti e Christina Holm per un&#39;eccellente assistenza tecnica. Questo lavoro è stato finanziato da Howard Hughes Medical Institute (sovvenzione 55.005.511), la Fondazione Lundbeck (sovvenzione R9-A840) e dalla Fondazione Niels Bohr.

1. Generazione di appena selezionati eritrociti infetti Per questo test, i risultati migliori si ottengono utilizzando colture appena selezionati per espressione di superficie di PfEMP1 proteine. In questo esperimento particolare, il P. 3D7 lineage falciparum è stato selezionato utilizzando anticorpi specifici come descritto in precedenza 1. Giorno 1 <ol><li> Harvest 200 pl di globuli confezionati da un P. falciparum coltura ...

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	<li>Joergensen, L., Bengtsson, D. C., Bengtsson, A., Ronander, E., Berger, S. S., Turner, L., Dalgaard, M. B., Cham, G. K., Victor, M. E., Lavstsen, T., Theander, T. G., Arnot, D. E., Jensen, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+co-expression+of+two+different+PfEMP1+antigens+on+single+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+facilitates+binding+to+ICAM1+and+PECAM1.">Surface co-expression of two different PfEMP1 antigens on single Plasmodium falciparum-infected erythrocytes facilitates binding to ICAM1 and PECAM1.</a> PLoS Pathog. 2, 1001083 (2010).</li><li>Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+two+mRNA+species+at+single-cell+resolution+by+double-fluorescence+in+situ+hybridization.">Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization.</a> Nat. Protoc. 3, 1370-1379 (2008).</li><li>Cheeseborough, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> District Laboratory Practice in Tropical Countries. , (2006).</li><li>Brolin, K. J., Ribacke, U., Nilsson, S., Ankarklev, J., Moll, K., Wahlgren, M., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+transcription+of+duplicated+var2csa+gene+copies+in+individual+Plasmodium+falciparum+parasites.">Simultaneous transcription of duplicated var2csa gene copies in individual Plasmodium falciparum parasites.</a> Genome Biol. 10, R117 (2009).</li><li>Epp, C., Li, F., Howitt, C. A., Chookajorn, T., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+associated+sense+and+antisense+noncoding+RNAs+are+transcribed+from+the+var+gene+family+of+virulence+genes+of+the+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum.">Chromatin associated sense and antisense noncoding RNAs are transcribed from the var gene family of virulence genes of the malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> RNA. 15, 116-127 (2009).</li><li>Freitas-Junior, L. H., Hernandez-Rivas, R., Ralph, S. A., Montiel-Condado, D., Ruvalcaba-Salazar, O. K., Rojas-Meza, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+heterochromatin+propagation+and+histone+acetylation+control+mutually+exclusive+expression+of+antigenic+variation+genes+in+malaria+parasites.">Telomeric heterochromatin propagation and histone acetylation control mutually exclusive expression of antigenic variation genes in malaria parasites.</a> Cell. 121, 25-36 (2005).</li><li>Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locked+nucleic+acid-based+in+situ+detection+of+microRNAs+in+mouse+tissue+sections.">Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections.</a> Nature Protoc. 2, 1508-1514 (2007).</li><li>Li, F., Sonbuchner, L., Kyes, S. A., Epp, C., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+non-coding+RNA+are+transcribed+from+the+centromeres+of+Plasmodium+falciparum+and+are+associated+with+centromeric+chromatin.">Nuclear non-coding RNA are transcribed from the centromeres of Plasmodium falciparum and are associated with centromeric chromatin.</a> J. Biol. Chem. 283, 5692-5698 (2008).</li><li>Thompson, J., Sinden, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+Pbs21+mRNA+during+sexual+development+of+Plasmodium+berghei.">In situ detection of Pbs21 mRNA during sexual development of Plasmodium berghei.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 68, 189-196 (1994).</li><li>Thompson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+RNA+in+blood-+and+mosquito-stage+malaria+parasites.">In situ detection of RNA in blood- and mosquito-stage malaria parasites.</a> Methods Mole Med. 72, 225-235 (2002).</li><li>Arnot, D. E., Ronander, E., Bengtsson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progression+of+the+intra-erythrocytic+cell+cycle+of+Plasmodium+falciparum+and+the+role+of+the+centriolar+plaques+in+asynchronous+mitotic+division+during+schizogony.">The progression of the intra-erythrocytic cell cycle of Plasmodium falciparum and the role of the centriolar plaques in asynchronous mitotic division during schizogony.</a> Int. J. Parasitol. 41, 71-80 (2011).</li><li>Osborne, C. S., Chakalova, L., Brown, K. E., Carter, D., Horton, A., Debrand, E., Goyenechea, B., Mitchell, J. A., Lopes, S., Reik, W., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+genes+dynamically+colocalize+to+shared+sites+of+ongoing+transcription.">Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription.</a> Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).</li></ol>

Analisi FISH RNA, a differenza di metodi come Northern blotting e RT-PCR, permette la discriminazione di mRNA trascritti specifici a livello di singola cellula. Ciò rende possibile discriminare tra cellule trascrizionalmente attiva e inattiva, in questo esempio, P. falciparum protozoi parassiti all&#39;interno globuli rossi umani. Tali cellule intere osservazioni sono spesso necessari e possono svelare modelli trascrizionali importanti e nuovi 1. Sebbene altri metodi FIS...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Acido acetico </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> 338826-100ml </td><td></td></tr><tr><td> Albumax media: RPMI 1640 soluzione Glutammina </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 ml RPMI 1640 5 ml di soluzione di glutammina </td></tr><tr><td> Albumax media: Gentamicina solfato Albumax soluzione </td><td> Lonza </td><td> BE02-012E </td><td> 2,5 ml di gentamicina solfato 50 ml di soluzione Albumax </td></tr><tr><td> Albumax-soluzione: ipoxantina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9377 </td><td> 0,8 g ipoxantina </td></tr><tr><td> Albumax-soluzione: Albumax II </td><td> Ionvitrogen </td><td> 11021-037 </td><td> 200 g Albumax </td></tr><tr><td> Albumax-soluzione: RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 4 litro RPMI 1640 Sciogliere con magnete al max. 50 ° C. Filtro sterilizzare e conservare a -20 ° C in aliquote. </td></tr><tr><td> Amberlite </td><td> Sigma </td><td> A5710-110G </td><td> Resina deionizzare formammide. </td></tr><tr><td> Anti-biotina capra pAb Coniugato perossidasi </td><td> Calbiochem </td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Dig anticorpo </td><td> Novus Biologicals </td><td> NB100-41330 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-fade reagente con DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td> I mezzi di montaggio deve curare per 24 h prima di sigillare il vetrino completamente. </td></tr><tr><td> Biotina RNA Labeling Mix </td><td&gt; Roche </td><td> 11685597910 </td><td></td></tr><tr><td> Fotocamera digitale </td><td> Digitale Nikon vista DC-F11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Coprioggetto </td><td> Menzel-Glaser </td><td> 631-1570 </td><td></td></tr><tr><td> cultura pallone 25 cm 2 di superficie Nunclon </td><td> Nunc </td><td> 156340 </td><td></td></tr><tr><td> DEPC </td><td> Fluka / Sigma </td><td> 32490-100ml </td><td> 1 ml DEPC in 1000 ml di acqua deinonized. Aggiungere una barra di agitazione e mescolare per 12 ore. Autoclave per 30 min. </td></tr><tr><td> Macchina fotografica digitale </td><td> Digitale Nikon vista DC-F11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads proteina A </td><td> Invitrogen </td><td> 10002D </td><td></td></tr><tr><td> DynaMaq-15 Magnete </td><td> Invitrogen </td><td> 123-01D </td><td></td></tr><tr><td> Formammide bioultra 99% </td><td> Fluka/ Sigma </td><td> 47671-1l-F </td><td> Formammide deionizzata: 5 g di resina scambiatrice di ioni per 100 ml di formammide. Mescolare 30 min. Filtrare su carta Whatman. </td></tr><tr><td> . Gelatina 0 soluzione al 75%: Gelatina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2500 </td><td> 3,75 g di gelatina in 500 ml di RPMI 1640. Riscaldare a 56 ° C per sciogliere. Filtro sterilizzare quando 56 ° C. Conservare a -20 ° C in aliquote. </td></tr><tr><td> . Gelatina 0 soluzione al 75%: RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 3,75 g di gelatina in 500 ml di RPMI 1640. Riscaldare a 56 ° C per sciogliere. Filtro sterilizzare quando 56 ° C. Conservare a -20 ° C in aliquote. </td></tr><tr><td> Glutammina soluzione: L-glutamina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G3126 </td><td> 14,6 g L glutammina in 500 ml di NaCl allo 0,9%. Sciogliere, filtro sterilize e conservare a -20 ° C in aliquote. </td></tr><tr><td> Glutammina soluzione: HCl </td><td> Sigma </td><td> H1758 </td><td> 14,6 g L glutammina in 500 ml di NaCl allo 0,9%. Sciogliere, filtro sterilizzare e conservare a -20 ° C in aliquote. </td></tr><tr><td> Ibridazione soluzione: Formamide Bio ultra 99% SSC 20x </td><td> Fluka / Sigma </td><td> 47671-1l-F </td><td> Totale 20 ml, mantenere congelato a -20 ° C in aliquote 10 ml di formammide deionizzata </td></tr><tr><td> Ibridazione soluzione: concentrato 50x Denhardt </td><td> Sigma </td><td> D2532 </td><td> 5ml 20xSSC </td></tr><tr><td> Ibridazione soluzione: reagente lievito tRNARoche blocco </td><td> Sigma </td><td> R-6750 </td><td> 2 ml 50x Denhardt 250 microlitri 20 mg al lievito tRNA ml </td></tr><tr><td><td> Fluka / Sigma </td><td> 31149-106GF </td><td> 0.4g Roche blocco reagente 1 ml di 10 mg per ml DNA di sperma di salmone (Critical: denaturano salmone spermDNA a 96 ° C per 5 minuti prima di aggiungere alla soluzione di ibridazione) </td></tr><tr><td> Hybridizer Thermostar 100 HC4 </td><td> Quantifoil Instruments GmbH </td><td> 1004-0011 </td><td> Può essere sostituito da forno di ibridazione e camere di ibridazione RNasi libero imbottiti con acqua DEPC. </td></tr><tr><td> Olio di immersione UV trasparente fluorescenza libero </td><td> Sigma </td><td> 10976-1EA </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio confocale o Immunofluorescenza </td><td> Nikon D-Eclipse TE2000C </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nailpolish </td><td> Disponibile in farmacia </td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBS 20x: NaCl KCl Na 2 HPO 4 x 2H 2 O KH 2 PO 4 DEPC deionizzata H 2 O </td><td></td><td></td><td> ASOLO pH a 7,4 160 g 4 g 23 g 4 g 1 l </td></tr><tr><td> Paraformaldeide 4% </td><td> Fluka / chemika </td><td> 76240 </td><td> 4 g PFA in 80 ml di PBS / DEPC. Riscaldare a 65 ° C fino alla PFA dissolve. Aggiungere 20 ml di PBS, lasciare che la soluzione si raffreddi. Regolare il pH a 7,4. Filtro. Conservare in aliquote a -20 ° C. </td></tr><tr><td> Paraformaldeide al 4% / acido acetico al 5% </td><td></td><td></td><td> 950 microlitri paraformaldhyde + 50 microlitri di acido acetico </td></tr><tr><td> Pepsina </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> P7000 </td><td></td></tr><tr><td> Perossidasi-coniugato anti-biotina </td><td> Calbiochem </td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td> RBC-wash media: RPMI 1640 soluzione Glutammina </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 ml RPMI 1640 5 ml soluzione glutammina </td></tr><tr><td> RBC-wash media: Gentamicina solfato </td><td> Lonza </td><td> BE02-012E </td><td> 2,5 ml di gentamicina solfato </td></tr><tr><td> RNasi </td><td> Sigma / Aldrich </td><td></td><td> Fai un 10 mg / ml di soluzione concentrata. </td></tr><tr><td> RNasi libero 1,5 ml tubo </td><td> Ambion </td><td> AM12450 </td><td></td></tr><tr><td> RNasi Zap </td><td> Ambion </td><td> AM9780 </td><td></td></tr><tr><td> Slides 4 pozzetti 11 millimetri </td><td> Thermo Scientific </td><td> MENZXER306W </td><td></td></tr><tr><td> SSC 20x: NaCl </td><td> Sigma / AlAldrich </td><td> S9625 </td><td> 3 M NaCl (175 g / l) 0,3 M Na 3 citrato x H 2 O (88 g / l) Regolare il pH a 7,0 con HCl 1M </td></tr><tr><td> SSC 20x: citrato di sodio diidrato </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> W302600 </td><td> 3 M NaCl (175 g / l) 0,3 M Na 3 citrato x H 2 O (88 g / l) Regolare il pH a 7,0 con HCl 1M </td></tr><tr><td> SSPE 20x: NaCl </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> S9625 </td><td> 175,3 g NaCl </td></tr><tr><td> SSPE 20x: NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> S0751 </td><td> 27,6 g di NaH 2 PO 4. </td></tr><tr><td> SSPE 20x: 4 EDTA in polvere </td><td></td><td></td><td> 9,4 g di polvere EDTA Aggiungere acqua DEPC, correggere il pH 7.4. Autospaccò per 20 min </td></tr><tr><td> TNB buffer: buffer di TNT </td><td></td><td></td><td> 10 ml tampone TNT </td></tr><tr><td> TNB buffer: reagente di blocco </td><td></td><td></td><td> 0,05 g di reagente di blocco Per sciogliere il reagente bloccante, riscaldare la soluzione a 60 ° C per un&#39;ora sotto agitazione. Conservare a -20 ° C. (Derivato dalla Perkin Elmer TSA-protocollo.) </td></tr><tr><td> TNT tampone: Tris / HCl </td><td> Sigma </td><td> T1503 </td><td> 1M Tris / HCl, pH 8,0 </td></tr><tr><td> TNT buffer: NaCl </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S9625 </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> TNT buffer: Tween20 </td><td> Sigma </td><td> 93773 </td><td> 5 M NaCl 30 ml 1 ml DEPC dH 2 O869 Ml Portare il pH a 7,5 a temperatura ambiente. (Derivato dalla Perkin Elmer TSA-protocollo.) </td></tr><tr><td> TSA più Cyanine3 / fluoresceina sistema </td><td> Perkin Elmer </td><td> NEL753000IKT </td><td> Leggi il protocollo dal TSA Plus System Palette fluorescenza con attenzione prima di iniziare l&#39;esperimento. </td></tr><tr><td> Tubi 14 ml sterile </td><td> Almeco - CM Aps LAB </td><td> 91016 </td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of single-cell gene transcription by rna fluorescent in situ hybridization (fish)

Adesione di Plasmodium falciparum eritrociti infetti (IE) per recettori umani endoteliali durante la malaria è mediato dall&#39;espressione di PfEMP1 varianti proteiche codificate dai geni var. Il aploide P. falciparum genoma ospita circa 60 differenti geni var di cui uno solo è creduto per essere trascritto per cella alla volta durante la fase di sangue dell&#39;infezione. Come tale regolamentazione si escludono a vicenda della trascrizione genica var si ottiene non è chiaro, così come l&#39;identificazione di singoli geni var o sotto-gruppi di geni associati con var diversi recettori e la conseguenza del legame differenziale sui risultati clinici di P. falciparum infezioni. Di recente, il paradigma trascrizione si escludono a vicenda è stata messa in dubbio da saggi di trascrizione sulla base di singoli P. falciparum identificazione trascrizione in inf singoloected cellule eritrocitari utilizzando RNA ibridazione fluorescente in situ (FISH) Analisi della trascrizione genica var dal parassita in singoli nuclei di P. falciparum IE 1. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per effettuare la RNA-FISH metodologia di analisi della trascrizione genica var in single-nuclei di P. falciparum infettato eritrociti umani. Il metodo si basa sull&#39;uso di digossigenina e biotina marcato con sonde di RNA antisenso utilizzando il sistema TSA Plus. Fluorescence Palette 2 (Perkin Elmer), analisi al microscopio e appena selezionato P. falciparum IE. Il metodo in situ può essere utilizzato per monitorare la trascrizione e la regolazione di una varietà di geni espressi durante le diverse fasi del P. ciclo di vita falciparum ed è adattabile ad altre specie parassita della malaria e di altri organismi e tipi di cellule.

La figura 1 illustra un diagramma di flusso delle fasi principali e la durata dell&#39;impulso del metodo FISH RNA. Una serie di immagini rappresentative di bene e male esperimenti mRNA conservati colorate FISH utilizzando una singola P. falciparum IE sono mostrati in Figura 2. Questo protozoo intracellulare ha una piccola (1-1,5 micron di diametro), nucleo che è di colore blu con DAPI. Ventiquattro ore dopo l&#39;invasione degli eritrociti in ...

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Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescente<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; (FISH) per identificare trascritti di mRNA in cellule singole consente analisi dell&#39;attività poligenici come la trascrizione simultanea di più di un membro della<em&gt; Var</em&gt; Multigene famiglia in<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Eritrociti infetti<sup&gt; 1</sup&gt;. La tecnica è adattabile e può essere utilizzato su diversi tipi di geni, cellule e organismi.

Analisi di Single-cell trascrizione del gene per l&#39;RNA fluorescente<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

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