Name: analysis of single-cell gene transcription by rna fluorescent in situ hybridization (fish)
Uploaded: 2012-10-07T14:00:00
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Os autores gostariam de agradecer a Michael Alifrangis e Ulla Abildtrup para a genotipagem de parasitas e Holm Christina de assistência técnica excelente. Este trabalho foi financiado pelo Howard Hughes Medical Institute (concessão 55.005.511), a Fundação Lundbeck (concessão R9-A840) e pela Fundação Niels Bohr.

1. Geração de recentemente selecionados eritrócitos infectados Para este ensaio, os melhores resultados são obtidos quando se utiliza as culturas de fresco seleccionados para a expressão de superfície da proteína PfEMP1. Nesta experiência particular, a P. 3D7 linhagem falciparum foi seleccionada utilizando anticorpos específicos como previamente descrito 1. Dia 1 <ol><li> Ul 200 de colheita de células do sangue compactados a ...

<ol>
	<li>Joergensen, L., Bengtsson, D. C., Bengtsson, A., Ronander, E., Berger, S. S., Turner, L., Dalgaard, M. B., Cham, G. K., Victor, M. E., Lavstsen, T., Theander, T. G., Arnot, D. E., Jensen, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+co-expression+of+two+different+PfEMP1+antigens+on+single+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+facilitates+binding+to+ICAM1+and+PECAM1.">Surface co-expression of two different PfEMP1 antigens on single Plasmodium falciparum-infected erythrocytes facilitates binding to ICAM1 and PECAM1.</a> PLoS Pathog. 2, 1001083 (2010).</li><li>Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+two+mRNA+species+at+single-cell+resolution+by+double-fluorescence+in+situ+hybridization.">Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization.</a> Nat. Protoc. 3, 1370-1379 (2008).</li><li>Cheeseborough, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> District Laboratory Practice in Tropical Countries. , (2006).</li><li>Brolin, K. J., Ribacke, U., Nilsson, S., Ankarklev, J., Moll, K., Wahlgren, M., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+transcription+of+duplicated+var2csa+gene+copies+in+individual+Plasmodium+falciparum+parasites.">Simultaneous transcription of duplicated var2csa gene copies in individual Plasmodium falciparum parasites.</a> Genome Biol. 10, R117 (2009).</li><li>Epp, C., Li, F., Howitt, C. A., Chookajorn, T., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+associated+sense+and+antisense+noncoding+RNAs+are+transcribed+from+the+var+gene+family+of+virulence+genes+of+the+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum.">Chromatin associated sense and antisense noncoding RNAs are transcribed from the var gene family of virulence genes of the malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> RNA. 15, 116-127 (2009).</li><li>Freitas-Junior, L. H., Hernandez-Rivas, R., Ralph, S. A., Montiel-Condado, D., Ruvalcaba-Salazar, O. K., Rojas-Meza, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+heterochromatin+propagation+and+histone+acetylation+control+mutually+exclusive+expression+of+antigenic+variation+genes+in+malaria+parasites.">Telomeric heterochromatin propagation and histone acetylation control mutually exclusive expression of antigenic variation genes in malaria parasites.</a> Cell. 121, 25-36 (2005).</li><li>Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locked+nucleic+acid-based+in+situ+detection+of+microRNAs+in+mouse+tissue+sections.">Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections.</a> Nature Protoc. 2, 1508-1514 (2007).</li><li>Li, F., Sonbuchner, L., Kyes, S. A., Epp, C., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+non-coding+RNA+are+transcribed+from+the+centromeres+of+Plasmodium+falciparum+and+are+associated+with+centromeric+chromatin.">Nuclear non-coding RNA are transcribed from the centromeres of Plasmodium falciparum and are associated with centromeric chromatin.</a> J. Biol. Chem. 283, 5692-5698 (2008).</li><li>Thompson, J., Sinden, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+Pbs21+mRNA+during+sexual+development+of+Plasmodium+berghei.">In situ detection of Pbs21 mRNA during sexual development of Plasmodium berghei.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 68, 189-196 (1994).</li><li>Thompson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+RNA+in+blood-+and+mosquito-stage+malaria+parasites.">In situ detection of RNA in blood- and mosquito-stage malaria parasites.</a> Methods Mole Med. 72, 225-235 (2002).</li><li>Arnot, D. E., Ronander, E., Bengtsson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progression+of+the+intra-erythrocytic+cell+cycle+of+Plasmodium+falciparum+and+the+role+of+the+centriolar+plaques+in+asynchronous+mitotic+division+during+schizogony.">The progression of the intra-erythrocytic cell cycle of Plasmodium falciparum and the role of the centriolar plaques in asynchronous mitotic division during schizogony.</a> Int. J. Parasitol. 41, 71-80 (2011).</li><li>Osborne, C. S., Chakalova, L., Brown, K. E., Carter, D., Horton, A., Debrand, E., Goyenechea, B., Mitchell, J. A., Lopes, S., Reik, W., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+genes+dynamically+colocalize+to+shared+sites+of+ongoing+transcription.">Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription.</a> Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).</li></ol>

RNA análise FISH, em contraste com os métodos tais como a Northern blotting e RT-PCR, permite a discriminação de transcritos de mRNA específicos ao nível da célula individual. Isto torna possível a discriminação entre as células transcricionalmente activos e inactivos, neste exemplo, P. falciparum protozoários parasitas dentro glóbulos vermelhos humanos. Tais células inteiras observações são muitas vezes necessário e pode desvendar importantes e romance padrões de transcrição 1. ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Ácido acético </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> 338.826-100ml </td><td></td></tr><tr><td> Albumax mídia: solução RPMI Glutamina 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 ml de RPMI 1640 Solução de 5 ml de glutamina </td></tr><tr><td> Albumax mídia: Gentamicina sulfato Albumax solução </td><td> Lonza </td><td> BE02-012E </td><td> 2,5 ml de gentamicina sulfato 50 ml solução Albumax- </td></tr><tr><td> Albumax solução: Hipoxantina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9377 </td><td> 0,8 g Hipoxantina </td></tr><tr><td> Albumax solução: AlbuMAX II </td><td> Eunvitrogen </td><td> 11021-037 </td><td> 200 g Albumax </td></tr><tr><td> Albumax solução: RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 4 litros RPMI 1640 Dissolver com ímã no máximo. 50 ° C. Filtrar esterilizar e armazenar a -20 ° C em alíquotas. </td></tr><tr><td> Amberlite </td><td> Sigma </td><td> A5710-110G </td><td> Resina para deionize formamida. </td></tr><tr><td> Anti-biotina de cabra conjugado com peroxidase de pAb </td><td> Calbiochem </td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Dig anticorpo </td><td> Novus biológicos </td><td> NB100-41330 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-fade reagente com DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td> Os meios de montagem tem a curar durante 24 h antes de selar completamente a lâmina. </td></tr><tr><td> Biotina RNA Labeling Mix </td><td&gt; Roche </td><td> 11685597910 </td><td></td></tr><tr><td> Câmera digital </td><td> Nikon vista digital DC-F11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lamelas </td><td> Menzel-glaser </td><td> 631-1570 </td><td></td></tr><tr><td> cultura em balão de 25 centímetros de superfície 2 Nunclon </td><td> Nunc </td><td> 156340 </td><td></td></tr><tr><td> DEPC </td><td> Fluka / Sigma </td><td> 32.490-100ml </td><td> 1 ml DEPC em 1000 ml de água deionizada. Adicionar uma barra de agitação e agita-se durante 12 h. Autoclave durante 30 minutos. </td></tr><tr><td> Câmera digital </td><td> Nikon vista digital DC-F11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads Proteína A </td><td> Invitrogen </td><td> 10002D </td><td></td></tr><tr><td> DynaMaq-15 Ímã </td><td> Invitrogen </td><td> 123-01D </td><td></td></tr><tr><td> Formamida 99% bioultra </td><td> Fluka/ Sigma </td><td> 47671-1l-F </td><td> Formamida desionizada: 5 g de resina de permuta iónica, por 100 ml de formamida. Agita-se 30 min. Filtrar através de papel Whatman. </td></tr><tr><td> Gelatina solução a 0 75%:. Gelatina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2500 </td><td> 3,75 g de gelatina em 500 ml de RPMI 1640. Aquece-se a 56 ° C para dissolver. Filtrar esterilizar quando 56 ° C. Armazenar a -20 ° C em alíquotas. </td></tr><tr><td> Gelatina solução a 0 75%:. RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 3,75 g de gelatina em 500 ml de RPMI 1640. Aquece-se a 56 ° C para dissolver. Filtrar esterilizar quando 56 ° C. Armazenar a -20 ° C em alíquotas. </td></tr><tr><td> Solução de glutamina: L-glutamina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G3126 </td><td> 14,6 g de glutamina L em 500 ml de NaCl a 0,9%. Dissolver, filtro sterilize e armazenar a -20 ° C em alíquotas. </td></tr><tr><td> Solução de glutamina: HCl </td><td> Sigma </td><td> H1758 </td><td> 14,6 g de glutamina L em 500 ml de NaCl a 0,9%. Dissolver, filtrar esterilizar e armazenar a -20 ° C em alíquotas. </td></tr><tr><td> Solução de hibridação: Formamida 99% Bio ultra-SSC 20x </td><td> Fluka / Sigma </td><td> 47671-1l-F </td><td> 20 ml Total, manter congelados a -20 ° C em alíquotas 10 ml de formamida desionizada </td></tr><tr><td> Solução de hibridação: concentrado 50x Denhardt </td><td> Sigma </td><td> D2532 </td><td> 20xSSC 5ml </td></tr><tr><td> Solução de hibridação: Yeast tRNARoche reagente de bloqueio </td><td> Sigma </td><td> R-6750 </td><td> 2 ml de 50x Denhardt 250 mg 20 ul por ml de ARNt de levedura </td></tr><tr><td><sTrong&gt; Solução de Hibridação: DNA de esperma de salmão </td><td> Fluka / Sigma </td><td> 31.149-106GF </td><td> 0,4 g Roche bloqueio reagente 1 ml de 10 mg por ml de DNA de esperma de salmão (Crítica: desnaturar spermDNA salmão a 96 ° C durante 5 min antes da adição à solução de hibridação) </td></tr><tr><td> Hybridizer ThermoStar 100 HC4 </td><td> Quantifoil Instruments GmbH </td><td> 1004-0011 </td><td> Pode ser substituído por forno de hibridação e câmaras de hibridização RNAse preenchidos com água DEPC. </td></tr><tr><td> Imersão em óleo UV transparente fluorescência livre </td><td> Sigma </td><td> 10.976-1EA </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio de imunofluorescência ou confocal </td><td> Nikon D-Eclipse TE2000C </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nailpolish </td><td> Disponível em qualquer farmácia </td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBS 20x: NaCl KCl Na 2 HPO 4 2H 2 O x KH 2 PO 4 DEPC H2O deionizada </td><td></td><td></td><td> Ajust pH para 7,4 160 g 4 g 23 g 4 g 1 l </td></tr><tr><td> Paraformaldeído a 4% </td><td> Fluka / Chemika </td><td> 76240 </td><td> 4 g PFA em 80 ml de PBS / DEPC. Aquece-se a 65 ° C até que o PFA dissolve. Adicionar 20 ml de PBS, permitir que a solução arrefeça. Ajustar o pH a 7,4. Filtrar. Armazenar em alíquotas a -20 ° C. </td></tr><tr><td> Paraformaldeído a 4% / ácido acético a 5% </td><td></td><td></td><td> 950 paraformaldhyde ul + 50 ul de ácido acético </td></tr><tr><td> Pepsina </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> P7000 </td><td></td></tr><tr><td> Conjugado com peroxidase anti-biotina </td><td> Calbiochem </td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td> RBC-lavagem de mídia: solução RPMI Glutamina 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 ml de RPMI 1640 5 ml solução glutamina </td></tr><tr><td> RBC-lavagem de mídia: sulfato de gentamicina </td><td> Lonza </td><td> BE02-012E </td><td> 2,5 ml de gentamicina sulfato </td></tr><tr><td> RNase </td><td> Sigma / Aldrich </td><td></td><td> Faça um de 10 mg / ml de solução. </td></tr><tr><td> RNase livre tubo 1,5 ml </td><td> Ambion </td><td> AM12450 </td><td></td></tr><tr><td> RNase Zap </td><td> Ambion </td><td> AM9780 </td><td></td></tr><tr><td> Desliza 4 poços 11 milímetros </td><td> Thermo Scientific </td><td> MENZXER306W </td><td></td></tr><tr><td> SSC 20x: NaCl </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> S9625 </td><td> NaCl 3 M (175 g / l), 0,3 M de citrato de Na 3 x H 2 O (88 g / l) Ajustar o pH a 7,0 com HCl 1M </td></tr><tr><td> SSC 20x: citrato de sódio desidratado </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> W302600 </td><td> NaCl 3 M (175 g / l), 0,3 M de citrato de Na 3 x H 2 O (88 g / l) Ajustar o pH a 7,0 com HCl 1M </td></tr><tr><td> SSPE 20x: NaCl </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> S9625 </td><td> 175,3 g de NaCl </td></tr><tr><td> SSPE 20x: NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> S0751 </td><td> 27,6 g NaH 2 PO 4. </td></tr><tr><td> SSPE 20x: 4 EDTA pó </td><td></td><td></td><td> 9,4 g de EDTA em pó Adicione a água DEPC, ajustar o pH 7,4. Automáticoclave durante 20 min </td></tr><tr><td> TNB tampão: tampão TNT </td><td></td><td></td><td> 10 ml de tampão TNT </td></tr><tr><td> TNB buffer: reagente de bloqueio </td><td></td><td></td><td> Reagente de bloqueio 0,05 g Para dissolver o reagente de bloqueio, aquecer a solução a 60 ° C durante uma hora com agitação. Armazenar a -20 ° C. (Derivado da Perkin Elmer TSA-protocolo). </td></tr><tr><td> TNT buffer: Tris / HCl </td><td> Sigma </td><td> T1503 </td><td> 1M Tris / HCl, pH 8,0 </td></tr><tr><td> Tampão TNT: NaCl </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S9625 </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> TNT buffer: Tween20 </td><td> Sigma </td><td> 93773 </td><td> 5 M NaCl 30 ml 1 ml DEPC dH2O869 Ml Ajustar o pH para 7,5 à temperatura ambiente. (Derivado da Perkin Elmer TSA-protocolo). </td></tr><tr><td> TSA mais o sistema Cyanine3 / Fluoresceína </td><td> Perkin Elmer </td><td> NEL753000IKT </td><td> Leia o protocolo da TSA Plus Sistema Paleta de fluorescência cuidadosamente antes de iniciar o experimento. </td></tr><tr><td> Tubos de 14 ml estéril </td><td> Almeco - CM LAB Aps </td><td> 91016 </td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of single-cell gene transcription by rna fluorescent in situ hybridization (fish)

Adesão de eritrócitos infectados por Plasmodium falciparum (IE) para receptores endoteliais humanas durante infecções de malária é mediada pela expressão de PfEMP1 variantes proteicas codificadas pelos genes var. O P. haplóide falciparum genoma alberga aproximadamente 60 diferentes genes var de que um só tenha sido acreditados para ser transcrito por célula de cada vez, durante o estágio de sangue da infecção. Como regra, tais mutuamente exclusivos da transcrição de genes var é alcançado não é clara, assim como a identificação de genes individuais var ou sub-grupos de genes var associados com diferentes receptores e da consequência da ligação diferencial sobre os resultados clínicos de P. falciparum. Recentemente, o paradigma transcrição mutuamente exclusivos tem sido posta em dúvida por ensaios de transcrição com base no P. indivíduo falciparum identificação transcrição em inf únicoected células eritrocitários usando RNA hibridização in situ fluorescente (FISH) de análise de transcrição do gene var pelo parasita em núcleos individuais de P. falciparum IE 1. A seguir, apresentamos um protocolo detalhado para a realização do método RNA-FISH para análise da transcrição de genes var em núcleos única de P. falciparum infectados eritrócitos humanos. O método baseia-se na utilização de digoxigenina e biotina marcado com sondas de RNA anti-sentido, utilizando o sistema de Fluorescência de TSA Além paleta 2 (Perkin Elmer), as análises microscópicas e P. recém seleccionada falciparum IE. O método de hibridização in situ pode ser usado para controlar a transcrição e a regulação de uma variedade de genes expressos durante as diferentes fases do P. falciparum ciclo de vida e é adaptável a espécie de malária outros parasitas e outros organismos e tipos de células.

A Figura 1 ilustra um fluxograma dos passos principais e do tempo de duração da metodologia FISH RNA. Uma série de imagens representativas de bem e mal conservadas experiências FISH manchadas de mRNA utilizando P. única falciparum IE são mostrados na Figura 2. Este protozoário intracelular tem um núcleo (1-1,5 um de diâmetro) de pequeno porte, que é tingido de azul com DAPI. Vinte e quatro horas após a invasão dos eritrócitos e...

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Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Hibridização (FISH) para identificar transcritos de ARNm em células individuais permite a análise da actividade poligênica tais como a transcrição simultânea de mais do que um membro da<em&gt; Var</em&gt; Família multigênica em<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Eritrócitos infectados<sup&gt; 1</sup&gt;. A técnica é adaptável e pode ser usado em diferentes tipos de genes, células e organismos.

Análise de uma única célula de transcrição do gene pela RNA Fluorescente<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridização (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

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